響應(yīng)面法優(yōu)化嗜鹽紫色硫細(xì)菌283－1培養(yǎng)基

崔小華，楊素萍，姚鵬

（1.山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原030006；2.華僑大學(xué) 生物工程與技術(shù)系，福建 廈門361021；3.山西中醫(yī)學(xué)院 中西醫(yī)結(jié)合臨床醫(yī)學(xué)系，山西 太原030024）

紫色硫細(xì)菌是不產(chǎn)氧光合細(xì)菌中一個(gè)特殊的生理類群，屬于Proteobacteria門、Gammaproteobacteria綱、Chromatiales目，有 Chromatiaceae和 Ectothiorhodospiraceae兩個(gè)科［1］。它們大約出現(xiàn)在3.5Ga年前，生活在富含硫化物光照厭氧的環(huán)境中，能利用N2、H2S、H2、CO2和 NH3等原始大氣成分和太陽(yáng)能進(jìn)行不產(chǎn)氧的光能無(wú)機(jī)自養(yǎng)生長(zhǎng)，也能利用有機(jī)物作為電子供體進(jìn)行光能異養(yǎng)或化能異養(yǎng)生長(zhǎng)，對(duì)其進(jìn)行深入研究對(duì)于探索生命起源和地球進(jìn)化、自然界碳、氮、硫物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)化有重要的理論意義［2～4］。生產(chǎn)實(shí)踐中，紫色硫細(xì)菌因其特殊的生境和生理特點(diǎn)，在廢水處理、生產(chǎn)養(yǎng)殖、天然色素等方面有著廣闊應(yīng)用前景，尤其是它們能耐受高濃度的硫化物，在處理含有高濃度硫化物廢水中發(fā)揮著重要作用［5］。本實(shí)驗(yàn)室分離到一株含奧氏酮、耐高濃度硫化物、嗜鹽、耐堿紫色硫細(xì)菌菌株283－1，該菌株能氧化硫化物產(chǎn)生硫粒儲(chǔ)存在細(xì)胞內(nèi)，而且能以亞硝酸鹽作為唯一氮源，細(xì)胞含有奧氏酮類胡蘿卜素和強(qiáng)吸收峰位于830nm處的細(xì)菌葉綠素a［6］，對(duì)其光合作用元件，耐鹽機(jī)理和去除碳、氮、磷和有毒物質(zhì)硫化物進(jìn)行深入研究對(duì)于探索光合作用機(jī)理、抗逆機(jī)制和耐鹽機(jī)理和水質(zhì)凈化具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。但該菌株生長(zhǎng)速率慢，周期長(zhǎng)且菌體的生物量較低，難以滿足理論研究和實(shí)際應(yīng)用的要求。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇了響應(yīng)面設(shè)計(jì)法，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)Plackett－Burman設(shè)計(jì)篩選出對(duì)菌體生物量具有顯著影響作用的因子，然后通過(guò)最陡爬坡試驗(yàn)，確定接近顯著因子最佳響應(yīng)濃度，最后采用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選顯著因子的最優(yōu)水平，以期得到最優(yōu)培養(yǎng)基配方提高生物量，為菌株283－1的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

紫色硫細(xì)菌 Marichromatiunsp.283－1，Gen－Bank登錄號(hào)為EU057602，本實(shí)驗(yàn)室從青島鹽池鹵水中分離、鑒定并保存。

1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

菌種培養(yǎng)采用Pfennig紫色硫細(xì)菌培養(yǎng)基［7］。接種量為3%，培養(yǎng)條件為2500lux，30℃，光照厭氧，靜止培養(yǎng)5天。

1.3 生物量的測(cè)定

采用比濁法，以660nm吸光度（OD660）表示生物量。取適量培養(yǎng)液用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定OD660。

1.4 單因素試驗(yàn)

在Pfennig紫色硫細(xì)菌培養(yǎng)基中添加乙酸鈉，采用單因素優(yōu)化法，以菌體生物量為指標(biāo)，優(yōu)化了乙酸鈉，碳酸氫鈉、氯化銨、硫化鈉、硫酸鎂、無(wú)機(jī)鹽6個(gè)因子。

1.5 Plackett－Burman試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用2水平設(shè)計(jì)，對(duì)單因素試驗(yàn)選取的6個(gè)因素，進(jìn)行12次試驗(yàn)，篩選顯著影響因子。選取的因素、水平和試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1和表2。

表1 Plackett－Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett－Burman

表2 Plackett－Burman試驗(yàn)Table 2 Results of Plackett－Burman design

1.6 最陡爬坡試驗(yàn)

對(duì)1.5篩選出的顯著因子，根據(jù)Plackett－Burman試驗(yàn)結(jié)果擬合的一階模型方程的系數(shù)設(shè)計(jì)最陡爬坡的步長(zhǎng)，以坡的最高點(diǎn)作為后續(xù)中心組合的中心點(diǎn)。

1.7 響應(yīng)面分析

由最陡爬坡試驗(yàn)逼近最大響應(yīng)區(qū)域后，采用中心組合設(shè)計(jì)法對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)分析軟件Design－Expert分析，對(duì)得到的理論最高點(diǎn)做3次重復(fù)驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

經(jīng)過(guò)單因素試驗(yàn)，無(wú)機(jī)鹽溶液、硫酸鎂、碳酸氫鈉、氯化銨、硫化鈉和乙酸鈉的含量分別為1mL·L－1、0.5g·L－1、0.75g·L－1、4.5g·L－1、1g·L－1和1.5g·L－1時(shí)，培養(yǎng)菌懸液OD660最高，分別為0.68、0.70、0.80、0.80、1.00和1.80。以Pfennig培養(yǎng)基為對(duì)照，培養(yǎng)液OD660為0.45。根據(jù)單因子優(yōu)化的結(jié)果來(lái)設(shè)計(jì)Packett－Burman試驗(yàn)各因子的水平。

2.2 Plackett－Burman試驗(yàn)

各因子對(duì)菌體生物量影響的方差分析見(jiàn)表3。結(jié)果表明，6個(gè)因子對(duì)菌體生物量的影響有所不同，影響順序?yàn)橐宜徕c＞硫化鈉＞無(wú)機(jī)鹽＞碳酸氫鈉＞硫酸鎂＞氯化銨，其中乙酸鈉（A）和硫化鈉（F）在95%置信區(qū)間呈顯著影響。經(jīng)過(guò)擬合，各因素的效應(yīng)良好地符合一階模型方程，Y＝1.25＋0.23A－0.033B＋0.008D＋0.19F－0.014H－0.063J，R2＝0.9407。

表3 因素的效應(yīng)分析Table 3 Analysisof factors effect

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)Plackett－Burman試驗(yàn)選擇顯著因子進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)。A（乙酸鈉）和F（硫化鈉）的濃度見(jiàn)表4，其他因子對(duì)生物量沒(méi)有顯著影響，因此選擇2.1單因素試驗(yàn)優(yōu)化的因子濃度。由表4可知，A和F的最優(yōu)濃度在第3處理附近，因此選擇A（乙酸鈉）濃度1.5g·L－1，F(xiàn)（硫化鈉）濃度1.0g·L－1作為響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

表4 最陡爬坡試驗(yàn)的設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Design and results of the steepest ascent experiment

2.4 中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析

根據(jù)爬坡試驗(yàn)得到的中心點(diǎn)，對(duì)因子A和F進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，為使擬合方程具有旋轉(zhuǎn)性和通用性，中心點(diǎn)重復(fù)5次，星號(hào)臂長(zhǎng)為1.414，見(jiàn)表5。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6。利用Design－Expert軟件對(duì)表6數(shù)據(jù)分析，獲得回歸方程Y＝3.28－0.077A ＋0.089F ＋0.10AF －0.34A2－0.30 F2，其中Y為 OD660，R2＝0.9636?；貧w模型的方差分析見(jiàn)表7，表明該回歸模型高度顯著（p＜0.0001），失擬項(xiàng)不顯著，擬合方程的二次項(xiàng)、一次項(xiàng)和交互項(xiàng)都具有顯著差異，表明A和F這兩個(gè)因子對(duì)生物量的影響有交互作用。

表5 中心組合試驗(yàn)的因子和水平Table 5 Factors and levels for central composite experiment

表6 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值表Table 6 Result and design table ofcentral composite experiment

表7 回歸模型方差分析Table 7 ANOVA for the response surface experiment

回歸方程繪制的響應(yīng)曲面見(jiàn)圖1，拋物面開(kāi)口向下，曲面有最大值。擬合方程的極值點(diǎn)，即為A和F的最佳濃度，經(jīng)偏導(dǎo)求解A和F數(shù)值分別為1.45g·L－1和1.05g·L－1，對(duì)應(yīng)理論最大生物量（OD660）為3.28。

圖1 響應(yīng)面立體圖Fig.1 Response surface plot

2.5 優(yōu)化培養(yǎng)基的驗(yàn)證

優(yōu)化的培養(yǎng)基和初始培養(yǎng)基培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖2，與初始培養(yǎng)基相比，在優(yōu)化培養(yǎng)基中，菌體生長(zhǎng)沒(méi)有明顯的延滯期，生長(zhǎng)速率提高，最大生物量OD660達(dá)到3.12，與回歸方程預(yù)測(cè)值（3.28）基本一致，生物量提高了6倍以上。

3 結(jié)論與討論

響應(yīng)面分析法因試驗(yàn)次數(shù)少、周期短，求得的回歸方程精確度高，并且可以研究幾個(gè)因素之間的交互作用，因此是優(yōu)化培養(yǎng)基組分的一種有效方法。近年來(lái)該方法已廣泛應(yīng)用于各種培養(yǎng)基組分以及發(fā)酵條件的優(yōu)化［8～10］。經(jīng)過(guò)單因素試驗(yàn)，Plackett－Burman試驗(yàn)，最陡爬坡試驗(yàn)，中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析，獲得了最佳的培養(yǎng)基配方：乙酸鈉1.45g·L－1，碳酸氫鈉0.75g·L－1，氯化銨4.5g·L－1，硫酸鎂0.5g·L－1，硫化鈉1.05g·L－1，氯化鈣0.19g·L－1，氯化鉀0.34g·L－1，氯化鈉50g·L－1，VB1220μg·L－1，無(wú)機(jī)鹽溶液1mL·L－1。與初始Pfennig紫色硫細(xì)菌培養(yǎng)基［7］相比，潛伏期縮短，生長(zhǎng)速率加快，生物量明顯提高。因此，基于響應(yīng)面設(shè)計(jì)法得到的優(yōu)化培養(yǎng)基配方準(zhǔn)確可靠，為嗜鹽紫色硫細(xì)菌283－1的理論研究和實(shí)際應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

圖2 菌株283－1培養(yǎng)基優(yōu)化前（a）后（b）的生長(zhǎng)比較Fig.2 The growth of strain 283－1compared before and after optimization

［1］楊素萍，林志華，崔小華，等.不產(chǎn)氧光合細(xì)菌的分類學(xué)進(jìn)展［J］.微生物學(xué)報(bào)，2008，48（11）：1562－1566.

［2］Brocks J J，Love G D，Summons R E，et al.Biomarker evidence for green and purple sulphur bacteria in a stratified Palaeoproterozoic sea［J］.Nature，2005，437（7060）：866－870.

［3］Brocks J J，Schaeffer P.Okenane，a biomarker for purple sulfur bacteria（Chromatiaceae），and other new carotenoid derivatives from the 1640Ma Barney Creek Formation［J］.Geochimica et cosmochimica acta，2008，72（5）：1396－1414.

［4］Griffin B M，Schott J，Schink B.Nitrite，an electron donor for anoxygenic photosynthesis［J］.Science，2007，316（5833）：1870.

［5］袁盈波，潘志崇，張德民.一株光合細(xì)菌的分離及其硫化物的處理效果［J］.寧波大學(xué)學(xué)報(bào)：理工版，2010，23（2）：1－5.

［6］楊素萍，連建科，趙春貴，等.含奧氏酮嗜鹽紫色硫細(xì)菌分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析［J］.微生物學(xué)報(bào)，2008，48（5）：1－6.

［7］Pfennig N，Trüper H G.The Prokaryotes［M］.New York：Springer，1992（2）：3203－3205.

［8］Rujira Jitrwung，Viviane Yargeau.Optimization of media composition for the production of biohydrogen from waste glycerol［J］.International journal of hydrogen energy，2011，36：9602－9611.

［9］Ing L S，Chia Y K，F(xiàn)eng C H，et al.Use of surface response methodology to optimize culture conditions foriturin A production by Bacillus subtilis in solid－state fermentation［J］.Journal of the chinese institute of chemical engineers，2008，39：635－643.

［10］黃麗金，陸兆新，袁勇軍，等.響應(yīng)面法優(yōu)化唾液鏈球菌嗜熱亞種增殖培養(yǎng)基［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31（5）：27－31.