刺參機體酵母菌組成及其拮抗活性的研究

李明，馬悅欣，劉志明，楊志平，包鵬云，宋堅

(1.大連海洋大學農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧大連116023;2.大連匯新鈦設備開發(fā)有限公司，遼寧大連116000)

刺參Apostichopus japonicus是中國北方地區(qū)重要的海珍品之一，具有較高的營養(yǎng)價值、經(jīng)濟價值和藥用價值，目前已形成較大的產(chǎn)業(yè)規(guī)模。隨著養(yǎng)殖密度的增加以及海水污染程度的日益嚴重，各種疾病也隨之而來，病害已成為限制刺參養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要因素。刺參的病害主要是由細菌引起的，如刺參育苗期的爛邊病、爛胃病、化板癥，稚參培育階段的細菌性潰爛病，幼體培育及養(yǎng)成階段的皮膚潰爛病和急性口圍腫脹癥等，已報道的刺參病原生物主要有弧菌屬的細菌，還有假單胞菌屬、假交替單胞菌屬和希瓦氏菌屬的細菌［1-4］。目前，對于刺參疾病，傳統(tǒng)的防治方法是使用抗生素，這容易使細菌產(chǎn)生抗藥性［5］，不僅干擾水生動物腸道正常微生物區(qū)系［6］，還可能造成水產(chǎn)品中藥物殘留，并對人類健康產(chǎn)生不利的影響。已有研究表明，從健康動物體內分離病原菌的拮抗菌是篩選益生菌的有效途徑［7-8］。不同種類的酵母菌存在于不同水生動物的腸道、體表等部位［9-11］。本研究中，作者在對刺參機體酵母菌種群組成研究的基礎上，以刺參病原菌為指示菌對酵母菌的拮抗活性進行測定，旨在為進一步篩選防治刺參病害的益生菌提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

刺參樣品于2010年5月和2010年11月分別采自大連柏嵐子和黑石礁自然海域。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌的分離 將從海底取回的新鮮刺參用無菌海水沖洗后，取一定面積的表皮，以無菌解剖法取出其腸道和呼吸樹，將腸道內的內容物去除，分別在低溫下將各組織勻漿，與適量的無菌海水充分混勻，稀釋，取適宜的稀釋液0.1 mL涂布于PDA、YPD和MEA培養(yǎng)基上，于20℃下恒溫培養(yǎng)3～5 d，選取形態(tài)不同的菌落，經(jīng)劃線純化后進行鑒定。

1.2.2 酵母菌的鑒定 酵母菌DNA的提取參照文獻［12］中的方法，用引物NL-1/NL-4［13］對提取的DNA進行PCR擴增。反應體系共50 μL，包含10×PCR Buffer 3 μL，dNTPs 2 μL，MgCl2(25 mmol/L)3 μL，上、下游引物 (10 mmol/L)各 1 μL，Taq酶 (5 U)0.25 μL，DNA 模 板 2 μL，ddH2O 37.75 μL。反應程序為:94℃下預變性2 min;94℃下變性30 s，55℃下退火30 s，72℃下延伸1 min，共進行35個循環(huán);72℃下再延伸5 min。用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物送生工生物工程 (上海)有限公司進行測序。將各菌株序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行檢索，從Blast比對結果中取相似性最高的序列，用Mega 4.0進行統(tǒng)計和聚類分析［14］。采用鄰接法獲得分子系統(tǒng)樹，并通過自舉分析 (boostrap)進行置信度檢測，自舉數(shù)據(jù)集為1 000次。

1.2.3 酵母菌拮抗活性的測定 采用雙層瓊脂擴散法，將活化后的酵母菌菌株接種于PDA平板上培養(yǎng)2 d，然后覆蓋含有指示菌菌懸液 (培養(yǎng)過夜)的2216E半固體培養(yǎng)基，20℃下培養(yǎng)24 h后測定其抑菌圈直徑(Di)和菌落直徑(Dc)，通過兩者的比值(Di/Dc)確定其拮抗活性。指示菌為刺參潰爛病和急性口圍腫脹癥的病原菌，編號分別為BP12(Pseudomonas sp.)、HSX31(Vibrio sp.)、HSX32(Vibrio sp.)［1］、AP629(Shewanella marisflavi)［4］、NB13(Vibrio splendidus)、NB14(Vibrio sp.)、KW21(Marinomonas dokdonensis)和KW22(Vibrio splendidus)［2］。

1.2.4 拮抗物質的性質研究 取從腸道分離的C11、C14和C21菌株的發(fā)酵上清液，加入不同飽和度的硫酸銨進行沉淀，將沉淀溶解后用透析袋透析，將粗提物以燦爛弧菌NB13為指示菌，采用紙片法測定其抑菌活性。

將粗提物在70、80、90℃下處理1 h，分別取20 μL處理液進行抑菌活性的測定，以未作處理的粗提液的抑菌圈直徑作為對照，其抑菌活性設為100%。

在粗提液中分別加入蛋白酶K至終濃度為200 μg/mL，然后在37℃下處理1 h。分別取20 μL處理液進行抑菌活性的測定，以未作處理的粗提液的抑菌圈直徑作為對照，其抑菌活性設為100%。

所有處理均設3個重復。

2 結果

2.1 刺參機體酵母菌的組成

從大連柏嵐子海域不同刺參的體表、腸道和呼吸樹共分離出13株酵母菌，分別記為T11～T13，C11～C15，H11～H15;從大連市黑石礁海域不同刺參的腸道和呼吸樹共分離出10株酵母菌，分別記為C21～C22，H21～H28。依據(jù)菌株的26S rDNA序列同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析，將其鑒定為紅酵母屬Rhodotorula spp.、梅奇酵母屬 Metschnikowia sp.、絲孢酵母屬Trichosporon spp.、德巴利酵母屬Debaryomyces spp.、假絲酵母屬Candida spp.、有孢漢遜酵母屬Hanseniaspora sp.和畢赤酵母屬Pichia sp.(表1)，各菌株DNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1。

表1 刺參機體酵母菌菌株26S rDNA序列的Blast結果Tab.1 The Blast analysis of the 26S rDNA sequences in yeaste strains

2.2 酵母菌的抗菌活性

23株酵母菌中17株具有抗菌活性，拮抗率達到73.9%，其拮抗活性見表2。從表2可見:從體表分離出的3株菌中只有1株有拮抗活性，拮抗率為33.3%，從呼吸樹中分離出的13株中有9株有拮抗活性，拮抗率為69.2%，而從腸道分離出的7株酵母菌均具有拮抗活性，拮抗率達100%;C11菌株對7株指示菌有拮抗活性，C12、H12、C21和H23菌株對4株指示菌有拮抗活性;C11菌株 (紅酵母屬)的拮抗活性最強，對5株指示菌的拮抗活性 (Di/Dc)均在2以上，該菌株對指示菌NB13菌株的抑制作用見圖2，H23菌株 (假絲酵母屬)和C21(有孢漢遜酵母屬)菌株的拮抗活性次之。

圖1 刺參機體酵母菌菌株26S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of the yeast strains based on partial sequences of 26S rDNA sequences by Neighbor-joining method

圖2 C11菌株對指示菌NB13菌株的抑制作用Fig.2 Inhibition of strain C11 to indicator the yeast strain NB13

2.3 拮抗物質的性質

拮抗菌C11和C21菌株胞外產(chǎn)物經(jīng)35%～65%硫酸銨沉淀，C14菌株胞外產(chǎn)物經(jīng)45%～75%硫酸銨沉淀后，獲得的粗提物均對指示菌NB13菌株有拮抗活性(圖3)。將C14菌株粗提物在70℃下水浴1 h，其抑菌活性僅保留25%，在80℃和90℃下水浴1 h，其失去拮抗活性。該粗提物經(jīng)蛋白酶K處理后失去對NB13菌株的拮抗活性，說明該粗提物對酶比較敏感，由此可證實C14菌株的拮抗物質為蛋白質。

圖3 C14菌株胞外產(chǎn)物經(jīng)65%硫酸銨沉淀獲得的粗提物對NB13菌株的抑制作用Fig.3 Antibacterial activity of the extracellular product precipitated with 65%ammonium sulfate in the yeast strain C14

3 討論

目前對刺參酵母菌區(qū)系的研究報道很少，孫奕等［9］從靈山島、威海以及青島沿岸海區(qū)刺參的消化管和表皮上分離得到的酵母菌屬于球擬酵母屬Torulopsis、紅酵母屬 Rhodotorula、隱球酵母屬Cryptococcus和德巴利酵母屬Debaryomyces。本試驗中從大連柏嵐子海域刺參機體中分離到紅酵母屬、梅奇酵母屬和絲孢酵母屬的酵母菌;從黑石礁海域刺參機體中分離到紅酵母屬、德巴利氏酵母屬、假絲酵母屬、有孢漢遜酵母屬和畢赤酵母屬的酵母菌。

表2 酵母菌菌株對刺參病原菌的抗菌活性Tab.2 Antibacterial activities of yeasts to pathogens in sea cucumber Apostichopus japonicus

假絲酵母Candida spp.和紅酵母Rhodotorula spp.可從巴西東南部紅樹林生態(tài)系統(tǒng)中的食碎屑蟹(Sesarma rectum和Uca spp.)、雜食性蟹(Aratus pisonii和Goniopsis cruentata)、船蛆(Neoteredo reynei)、蛤(Anomalocardia brasiliana和 Tagelus plebeius)中分離到［15］。假絲酵母 Candida spp.、絲孢酵母Trichosporon sp.、德巴利酵母Debaryomyces sp.和紅酵母Rhodotorula spp.是凡納濱對蝦Penaeus schmitti腸道的優(yōu)勢酵母菌屬［16］;紅酵母常?？蓮暮Ｋ~的腸道分離出［11，17］，漢遜德巴利酵母、紅酵母和假絲酵母是虹鱒腸道中的優(yōu)勢種類［11，17］。池振明等［10］從天津大港區(qū)半滑舌鰨腸道和體表中以及山東榮成石島帶魚消化道中分離到漢遜德巴利酵母;從山東榮成石島馬面鲀消化道和鰓中以及鲅魚腸道和體表中分離出克魯弗畢赤酵母Pichia kluyveri;從山東榮成石島的鲅魚體表和腸道中分離出假絲酵母。因此，不同海水動物、不同海域同一動物體中的酵母菌組成有一定的差異，可能與其食物來源和組成及環(huán)境條件不同有關。

Wang等［18］以梭子蟹“乳化病”的病原菌梅奇酵母Metchnikowia bicuspidata WCY作為指示菌，對從海水、海泥、海水魚腸道中和海藻中分離的多株酵母菌進行拮抗活性的測定，結果發(fā)現(xiàn)其中5株嗜殺活性較高，并將其鑒定為土星擬威爾酵母Williopsis saturnus(WC91-2)、季也蒙畢赤酵母Pichia guilliermondii(GZ1)、異常畢赤酵母 P.anomala(YF07b)、漢遜德巴利酵母D.hansenii(HCX-1)和出芽短梗霉 Aureobasidium pullulans(HN2.3)。Andlid等［17］從虹鱒胃腸道分離的漢遜德巴利酵母(HF1)體外可抑制魚病原菌殺鮭氣單胞菌Aeromonas salmonicida和鰻弧菌Vibrio angiullarum。

從表2可見，本試驗中分離出的C11菌株、H23菌株和C21菌株對指示菌都有較好的抑制作用。從刺參腸道分離的拮抗菌C11、C21和C14菌株胞外產(chǎn)物經(jīng)硫酸銨沉淀后獲得的粗提物均對指示菌NB13菌株有拮抗活性;C14菌株的粗提物經(jīng)80℃和蛋白酶處理后失去拮抗活性，說明該菌株產(chǎn)生的胞外蛋白可抑制刺參病原菌的生長。薛德林等［19］研究表明，當海洋膠紅酵母 (質量濃度為1×1010cfu/mL)日投量為10 mL/m3(水體)時，刺參幼體爛胃病的發(fā)病率顯著低于對照組;在刺參成參養(yǎng)殖中，應用海洋膠紅酵母和光合細菌能夠提高刺參產(chǎn)量14.3%～16.4%，并可以有效地減少由弧菌引起的海參周身腐爛等病害。本實驗室后續(xù)的攻毒試驗表明，拮抗活性較高的菌株對刺參無致病性，有關這些菌株在刺參養(yǎng)殖過程中的應用效果正在研究中。

［1］馬悅欣，徐高蓉，常亞青，等.大連地區(qū)刺參幼參潰爛病細菌性病原的初步研究［J］.大連水產(chǎn)學院學報，2006，21(1):13-17.

［2］馬悅欣，徐高蓉，張恩鵬，等.仿刺參幼參急性口圍腫脹癥的細菌性病原［J］.水產(chǎn)學報，2006，30(3):378-382.

［3］王印庚，榮小軍，張春云，等.養(yǎng)殖海參主要疾病及防治技術［J］.海洋科學，2005，29(3):1-7.

［4］Li H，Qian G，Li Q，et al.Biological characteristics and pathogenicity of a highly pathogenic Shewanella marisflavi infected sea cucumber(Apostichopus japonicus)［J］.Journal of Fish Diseases，2010，33:865-877.

［5］Sahul Hameed A S，Rahaman K H，Alagan A，et al.Antibiotic resistance in bacteria isolated from hatchery-reared larvae and postlarvae of Macrobrachium rosenbergii［J］.Aquaculture，2003，217:39-48.

［6］Verschuere L，Rombaut G，Sorgeloos P，et al.Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture［J］.Microbiology and Molecular Biology Review，2000，64(4):655-671.

［7］周慧慧，馬洪明，張文兵，等.仿刺參腸道潛在益生菌對稚參生長、免疫及抗病力的影響［J］.水產(chǎn)學報，2010，34(6):775-783.

［8］張玲，譚北平，麥康森，等.中國對蝦體內1株益生菌的篩選與初步鑒定［J］.中國海洋大學學報，2008，38(2):225-231.

［9］孫奕，陳騳.刺參體內外微生物組成及其生理特性的研究［J］.海洋與湖沼，1999，20(4):300-307.

［10］池振明，居靚，王祥紅，等.在海洋環(huán)境中的酵母菌分布與多樣性［J］.中國海洋大學學報，2009，39(5):955-960.

［11］Gatesoupe F J.Live yeasts in the gut:natural occurrence，dietary introduction，and their effects on fish health and development［J］.Aquaculture，2007，267:20-30.

［12］薩姆布魯克J，拉塞爾D W.分子克隆實驗指南［M］.黃培堂，譯.北京:科學出版社，2002:485-487.

［13］O'Donnell K.Fusarium and its near relatives［C］//Reynolds D R，Taylor J W.The Fungal Holomorph:Mitotic，Meiotic and Pleomorphic Speciation in Fungal Systematics.Wallingford:CAB International，1993:225-233.

［14］Tamura K，Dudley J，Nei M，et al.Mega 4:Molecular evolutionary genetics analysis(Mega)software version 4.0［J］.Molecular Biology and Evolution，2007，24(8):1596-1599.

［15］De Araujo F V，Soares C A，Hagler A N，et al.Ascomycetous yeast communities of marine invertebrates in a southeast Brazilian mangrove ecosystem［J］.Antonie van Leeuwenhoek，1995，68(2):91-99.

［16］Pagnocca F G，Mendonca-Hagler L C，Hagler A N.Yeasts associated with the white shrimp Penaeus schmitti，sediment，and water of Sepetiba Bay，Rio de Janeiro，Brasil［J］.Yeast，1989，5:S479-S483.

［17］Andlid T，Juarez R V，Gustafsson L.Yeast colonizing the intestine of rainbow trout(Salmo gairdneri)and turbot(Scophthalmus maximus)［J］.Microbial Ecology，1995，30:321-347.

［18］Wang L，Yue L X，Chi Z M，et al.Marine killer yeast active against a yeast strain pathogenic to crab Portunus trituberculatus［J］.Diseases of Aquatic Organisms，2008，80(3):211-218.

［19］薛德林，胡江春，王國安，等.海洋膠紅酵母、光合細菌、生化黃腐酸在海參育苗和養(yǎng)成中的應用效果［J］.腐殖酸，2009(4):19-24.