3日齡大鼠缺氧缺血性腦損傷腦組織VEGF表達變化探討

劉利利

隨著圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)的進步，早產(chǎn)兒腦損傷日益成為近年來國內(nèi)外圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)和新生兒學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。研究報道，早產(chǎn)兒這種神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙主要由腦白質(zhì)損傷所致[1]。最近研究表明，眾多細胞因子參與早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷的發(fā)病過程。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種細胞因子，其在早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷中的作用日益受到關(guān)注。本實驗建立3日齡大鼠缺氧缺血性腦損傷模型，通過測定其后不同時間點腦白質(zhì)區(qū)VEGF蛋白質(zhì)的表達，探討其在3日齡未成熟大鼠缺氧缺血后的表達變化規(guī)律，進一步闡明VEGF在早產(chǎn)兒腦損傷發(fā)病機理中的作用，以期為早產(chǎn)兒腦損傷的防治開辟新的途徑，為臨床的進一步研究和應(yīng)用提供客觀實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 92只3日 齡(出 生 日 為0天)SD(Sprague-Dawley)大鼠，雌雄不限，體重6.5～10.5 g。隨機分為缺氧缺血模型組(以下簡稱實驗組)50只和假手術(shù)組(以下簡稱對照組)42只，各組間雌雄、體重比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。術(shù)前稱重及編號，實驗組動物用無水乙醚吸入麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺上，碘伏消毒手術(shù)區(qū)，緊貼氣管右側(cè)做一約1 cm縱切口，切開皮膚及皮下組織，分離肌層，暴露右側(cè)頸總動脈，并用9-0絲線結(jié)扎，縫合傷口，再次消毒，表皮滴少量青霉素注射液。手術(shù)于5 min內(nèi)完成。術(shù)后讓實驗鼠于37 ℃水浴箱中恢復(fù)2 h，后置于透明密封箱內(nèi)，輸入含氧氣6%、氮氣94%的混合氣體，氣體流量1.5 L/min，測氧儀監(jiān)測得箱內(nèi)O2濃度為6%，4 h后取出，放回原飼養(yǎng)環(huán)境中繼續(xù)母乳喂養(yǎng)。對照組同樣分離頸總動脈，然后僅將手術(shù)線從右側(cè)頸總動脈穿過而不予以結(jié)扎，也不予以缺氧處理。整個手術(shù)及缺氧過程中，保持周圍環(huán)境溫度為30 ℃以上。實驗組有10只大鼠因不能耐受手術(shù)，分別在手術(shù)中和手術(shù)后死亡。對照組有2只不明原因死亡。兩組大鼠共80只(實驗組和對照組各40只)分別于缺氧缺血后12、24、48、72 h及7 d處死(每組各時間點8只)。

1.2 取材及切片制備

1.2.1 取材 大鼠乙醚吸入麻醉后，開胸暴露心臟，經(jīng)左心室灌注肝素化0.9%生理鹽水20 ml，同時在右心耳處剪一切口，至流出液體變清為止。繼予以4%冰多聚甲醛30 ml灌注，至肝臟明顯變白及肺臟明顯水腫、四肢完全僵直后，美藍標記前囟位置，立即開顱取腦組織，將標本于4%冰多聚甲醛固定12 h，將固定的鼠腦從前囟后以視交叉為中心前后3 mm取材，再固定24 h。

1.2.2 切片制備 標本組織塊經(jīng)梯度脫水、浸蠟、包埋。包埋后的組織蠟塊連續(xù)切片，厚度為3 μm，每塊組織取連續(xù)切片2張(1張HE染色，1張免疫組化)，分別裱于經(jīng)APES處理的載玻片上，做免疫組化染色。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色法(SABC法)檢測腦組織內(nèi)VEGF的表達。

1.3 陽性結(jié)果的判定及計數(shù)方法 (1)陽性細胞的判斷：VEGF顯色主要在胞漿，有明確棕色或棕黃色染色為陽性細胞；iNOS顯色定位于細胞漿/膜，有棕黃色染色為陽性細胞；(2)陽性細胞分級及計數(shù)方法：通過計算陽性細胞的比例和細胞染色強度，半定量評定VEGF及iNOS蛋白的表達。①根據(jù)陽性細胞所占的比例分為3個等級。1級：陽性細胞數(shù)<10%；2級：陽性細胞數(shù)10%～50%；3級：陽性細胞數(shù)>50%。②根據(jù)陽性細胞的染色強度分為5個等級。1級：陰性或微弱染色；2級：≤50%陽性細胞中等強度染色；3級：>50%陽性細胞中等強度染色；4級：≤50%陽性細胞高強度染色；5級：>50%陽性細胞高強度染色。

每組每個時間點各觀察8只大鼠，每只大鼠取相鄰切片2張，每張切片于右側(cè)腦室周圍白質(zhì)和胼胝體區(qū)，各觀察3個不重疊的高倍視野(10×40)，取這3個視野細胞染色強度的等級平均值與陽性細胞比例等級數(shù)相乘，結(jié)果用任意單位(arbitraryunits，AU)值表示[2]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 11.5進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料以(±s)表示，表示成組設(shè)計的兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗，多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way-ANOVA)，兩兩比較，方差齊者用LSD法，方差不齊者用Duttet′T3法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

各組大鼠腦組織均可見VEGF蛋白的少量表達，免疫陽性細胞呈棕黃色表達于細胞漿中，細胞核為淺藍色。VEGF在腦組織中呈廣泛表達，主要見于胼胝體區(qū)、腦室周圍白質(zhì)的膠質(zhì)細胞、海馬、皮質(zhì)區(qū)的神經(jīng)元、內(nèi)皮細胞、軟腦膜細胞等。對照組胼胝體和腦室周圍白質(zhì)VEGF的表達較弱，且隨日齡的增加表達沒有明顯變化，組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。實驗組VEGF陽性細胞在腦室周圍白質(zhì)和胼胝體區(qū)反應(yīng)性增加，于缺氧缺血12 h表達開始增加，24 h表達達到高峰，7 d時恢復(fù)至正常，組間各時間點比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。實驗組胼胝體、腦室周圍白質(zhì)VEGF的表達在12、24、48、72 h與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，7 d與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。HI對側(cè)亦有VEGF陽性細胞，但明顯少于缺血側(cè)。見表1、2。

表1 腦室周圍白質(zhì)VEGF表達(AU值)(±s)

表1 腦室周圍白質(zhì)VEGF表達(AU值)(±s)

注:實驗組各時間點間兩兩比較，P<0.05，F(xiàn)=36.88

組別 12 h 24 h 48 h 72 h 7 d對照組 (n=40) 2.71±0.79 2.88±0.99 2.63±0.95 2.63±0.92 2.83±0.82實驗組 (n=40) 5.67±0.80 12.0±2.14 9.0±2.14 7.29±1.16 3.13±1.04 t值 7.47 10.95 7.71 8.93 0.62 P值 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 >0.05

表2 胼胝體區(qū)VEGF表達(AU值)(±s)

表2 胼胝體區(qū)VEGF表達(AU值)(±s)

注：驗組各時間點間兩兩比較，P<0.05，F(xiàn)=43.28

組別 12 h 24 h 48 h 72 h 7 d對照組 (n=40) 2.71±0.79 2.92±1.05 2.71±0.98 2.54±0.85 2.67±1.01實驗組 (n=40) 5.33±1.13 12.50±1.41 8.75±2.25 6.92±0.85 3.88±1.33 t值 5.40 15.39 6.96 10.27 1.55 P值 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 >0.05

3 討論

隨著圍產(chǎn)保健及對宮內(nèi)感染認識的重視，現(xiàn)臨床所見宮內(nèi)感染造成的腦白質(zhì)損傷病例已逐漸下降。因此，缺氧缺血成為早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷的主要原因。缺氧缺血后，機體所誘發(fā)的一系列病理生理過程是諸多因素共同作用的結(jié)果。近年來，各種細胞因子的研究受到關(guān)注并取得較大進展。其中VEGF作為一種腦保護因子，其作用亦顯重要。VEGF是Ferrara等[3]1989年首先從牛垂體的濾泡星狀細胞中純化出的同源二聚體糖蛋白。其分子量40～45 KD，耐酸、耐熱，等電點>7.5。人VEGF基因位于6號染色體Gp21.3，全長14 kb，包括8個外顯子、7個內(nèi)含子，至少以6種亞型存在，分別為VEGF-A(VEGF165)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E及胎盤生長因子(PIGF)。在正常成人和動物組織中水平很低，而在某些病理情況下，如缺血、缺氧時，VEGF表達明顯增加，尤以腦組織中VEGF表達升高明顯[4]。VEGF是內(nèi)皮細胞的強力絲裂劑，具有強大促進新血管生成作用，是最具特異性且作用最強的內(nèi)源性血管生成因子。VEGF需與存在于內(nèi)皮細胞表面的特異性受體(Flt-1，F(xiàn)lk-1/KDR)結(jié)合，促進血管內(nèi)皮細胞增殖，刺激體內(nèi)新生血管生成。關(guān)于VEGF在未成熟大鼠缺氧缺血性腦白質(zhì)損傷的表達變化，國內(nèi)外少見報道。

在實驗中發(fā)現(xiàn)，各組大鼠腦組織均可見VEGF蛋白的少量表達，免疫陽性細胞呈棕黃色表達于細胞漿中，細胞核為淺藍色。VEGF在腦組織中呈廣泛表達，主要見于胼胝體區(qū)、腦室周圍白質(zhì)的膠質(zhì)細胞、海馬、皮質(zhì)區(qū)的神經(jīng)元、內(nèi)皮細胞、軟腦膜細胞等。VEGF于缺氧缺血12 h表達開始增加，缺氧缺血24 h表達達到高峰，缺氧缺血72 h仍有表達，7 d時恢復(fù)至正常。該結(jié)果考慮與HI腦組織通過VEGF表達促進血液再灌注及供氧量的增加，促進腦白質(zhì)少突膠質(zhì)細胞生理功能的恢復(fù)有關(guān)。其表達呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，這一結(jié)果與國外和國內(nèi)一些研究一致。Ogunshola等[5]將新生大鼠出生后置于含90.5%氮氣及9.5%氧氣的缺氧條件下，發(fā)現(xiàn)VEGF蛋白在生后第8天表達明顯增加，并持續(xù)至生后33 d，說明缺氧可誘導(dǎo)VEGF蛋白的表達。國內(nèi)秦元華等[6]研究VEGF在7日齡SD大鼠HIBD后腦組織中的表達變化得出，VEGF在模型后即刻即有表達，12 h達到高峰，隨后下降，7 d后呈低水平表達，說明大腦缺氧缺血會產(chǎn)生VEGF的高表達，且隨時間波動。其結(jié)果的差異可能與動物模型、動物日齡不同、缺氧時間及濃度不同等有關(guān)。

在實驗中還發(fā)現(xiàn)，實驗組大鼠VEGF的表達明顯高于對照組，且缺氧缺血側(cè)腦白質(zhì)VEGF的表達明顯高于對側(cè)。這一發(fā)現(xiàn)也與國外及國內(nèi)研究一致。國外Lennmyr等[7]發(fā)現(xiàn)，在腦缺血缺氧后，神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞VEGF的表達增強。國內(nèi)于慕剛等[8]觀察7日齡大鼠HI后不同時間點VEGF和新生血管的表達，得出結(jié)論為，HI可誘導(dǎo)VEGF表達增加，VEGF參與了HI后腦組織新生血管的形成。

本實驗表明，3日齡大鼠腦缺氧缺血可誘導(dǎo)腦白質(zhì)內(nèi)源性VEGF的表達增強，這可能是機體對抗缺血所引起的腦白質(zhì)損害的一種自身保護方式。但機體的這種反應(yīng)尚不足以促進腦缺氧缺血后的神經(jīng)功能康復(fù)，適時地激活內(nèi)源性VEGF表達或應(yīng)用外源性VEGF，充分發(fā)揮其神經(jīng)保護、神經(jīng)再生及血管再生的作用，可能為早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷的治療提供廣闊的前景。本結(jié)果為以后開展VEGF干預(yù)治療打下了實驗基礎(chǔ)。

[1] Volpe J J.Periventricular leukomalacia in the premature infant[J].Pediatr Res，2001，50(5):553-562.

[2] Mesters R M，Padro T，Bicker R，et al.Satble remission after administration of thereceptor tyrosine kinase inhibitor SU5416 in a patient with refratory acute myeloid leukemia[J].Blood，2001，1998(1):241-243.

[3] Ferrara N，Henzel W J.Pituitary follicular cells secrete a novel heparinbinding growth factor specific for vascular endothelial cells[J].Biochem Biophys Res Commum，1989，161(2):851-858.

[4] Marti H H，Risau W.Systemic hypoxia changes the organ-specific distribution of vascular endothelial growth factor and its receptors[J].Proc Natl Acad Sci USA，1998，95(26):15809-15814.

[5] Ogunshola O O，Stewart W B，Mihalcik V，et al.Neuronal VEGF expression correlates with angiogenesis in postnatal developing rat brain[J].Dev Brain Res，2000，119(1):139-153.

[6] 秦元華，徐立新，屈云霞，等.新生鼠缺氧缺血性腦損傷后血管內(nèi)皮生長因子的變化[J].新生兒科雜志，2004，19(2):65-68.

[7] Lennmyr F，Ata K A，F(xiàn)una K，et al.Expression of vascular endothelial growth factor(VEGF) and its receptor(flt-1 and flk-1)following permnent and transient occlusion of the middle cerebral artery in the rats[J].Neuropathor Exp Neurol，1998，57(9):874-882.[8] 于慕剛，吳明哲，王華，等.新生大鼠缺氧缺血性腦損傷血管內(nèi)皮生長因子表達與新生血管形成關(guān)系的研究[J].中國小兒急救醫(yī)學(xué)，2007，14(1):45-47.