西藏林芝地區(qū)黑木耳優(yōu)良菌株的篩選與鑒定*

劉振東，趙丹丹，孫 越，王 靜，雷 虹，董澤軍，張彥龍**

（1.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，微生物黑龍江省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150080；2.中科院昆明植物研究所，植物化學(xué)與西部植物資源持續(xù)利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650204）

黑木耳也稱木耳、云耳、光木耳，是木耳屬中分布最廣泛的種之一[1]，它隸屬于擔(dān)子菌門、層菌綱、木耳科、木耳屬，學(xué)名為Auricularia auricula（L.ex Hook） underw[2]。

西藏林芝地區(qū)位于青藏高原東南部，雅魯藏布江下游，被喜馬拉雅山脈、念青唐古拉山脈和橫斷山脈形成的群山環(huán)繞[3]，自然條件復(fù)雜而獨(dú)特，由于受印度洋季風(fēng)影響，這里夏季雨量充沛，形成了豐富多樣的植物及森林植被，同時(shí)林下也孕育著大量的食用菌資源，由于西藏獨(dú)特的地理?xiàng)l件，使該地區(qū)的野生食用菌的種質(zhì)資源相對獨(dú)立。當(dāng)?shù)禺a(chǎn)的野生黑木耳，耳形好，口感佳，深受廣大消費(fèi)者的青睞。我國目前用于生產(chǎn)的黑木耳菌種老化、產(chǎn)量下降，同種異名的現(xiàn)象十分嚴(yán)重，因而遠(yuǎn)源新品種的開發(fā)對黑木耳產(chǎn)業(yè)的發(fā)展至關(guān)重要。本研究通過對在林芝地區(qū)不同地點(diǎn)采集到的20株優(yōu)良菌株，進(jìn)行篩選與鑒定，最后得到1株優(yōu)良菌株。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 培養(yǎng)基

母種培養(yǎng)基配方（cPDA培養(yǎng)基）：去皮馬鈴薯200 g（煮汁100 mL）、葡萄糖20.0 g、KH2PO43.0 g、MgSO41.5 g、瓊脂14.0 g，補(bǔ)水至1 000 mL。

原種培養(yǎng)基配方：木屑（闊葉硬雜木）78%、麥麩（或米糠）20%、石膏1%、白砂糖1%，含水量60%。

栽培種培養(yǎng)基配方：木屑（闊葉硬雜木）84%、麥麩10%、黃豆粉2%、玉米粉2%、石灰1%、石膏1%，含水量65%。

cPDA液體培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g（煮汁1 000 mL）、葡萄糖20.0 g、硫酸鎂1.5 g、磷酸二氫鉀3.0 g、蛋白胨0.5 g、維生素B110.0 mg，加蒸餾水定容至1 000 mL。

1.1.2 菌株

篩選菌株：從西藏林芝地區(qū)米林、郎縣、工布江達(dá)、波密、察隅、墨脫等地的20個(gè)不同地點(diǎn)采集得到，編號為X1~X20。

對照菌株黑29（黑龍江省應(yīng)用微生物研究所）、9809（東寧縣食用菌研究所）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 純種分離

首先將野外采集的野生菌株標(biāo)本核對原始序號，后用高錳酸鉀-甲醛溶液進(jìn)行熏蒸處理30 min，最后將處理過的子實(shí)體置于超凈工作臺上進(jìn)行無菌分離[4]，將分離出來的黃豆粒大小的子實(shí)體接種到PDA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)15 d后，對菌絲進(jìn)行純化，方法是在菌落邊緣挑取尖端菌絲體，移殖到試管培養(yǎng)基斜面上，在25℃下培養(yǎng)，如此重復(fù)3次。純化后的菌種接入裝有木屑培養(yǎng)基的試管中，作為備份。

1.2.2 初篩（生理性能測定）

將分離得到的20株菌株與對照菌株，分別接種到PDA綜合培養(yǎng)基，置于24℃~25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24 h觀察1次，并記錄各菌絲的生長速度及菌落形態(tài)，并用瓊脂糖擴(kuò)散法[5]進(jìn)行拮抗分析。拮抗反應(yīng)的形態(tài)特征按照《綠色食品食用菌NY/T749-2003》規(guī)定的定義判[6]。

1.2.3 復(fù)篩（菌株比較試驗(yàn)）

將初篩入選的8株菌株進(jìn)行復(fù)篩，每個(gè)菌株分別培養(yǎng)1 000袋栽培種，從中隨機(jī)抽取400袋進(jìn)行栽培試驗(yàn)。具體擴(kuò)培比例是1支試管一級菌種→5袋二級菌種→400袋三級菌（栽培種），在菌種逐級擴(kuò)培過程中定時(shí)觀察，記錄各菌株在各級培養(yǎng)基上的萌發(fā)時(shí)間、菌絲生長情況、抗污染能力。在田間管理階段觀察記錄個(gè)菌種子實(shí)體的產(chǎn)量及商品性能。

纖維素酶活力測定，用3,5-二硝基水楊酸法[7]測定菌絲生長階段和出耳階段的纖維素酶活力，接種20 d后，定期對菌袋取樣，每次取培養(yǎng)料20.0 g放于燒杯中，加入40 mL生理鹽水后立即封口，在40℃水浴條件下提取酶液后過濾，并吸取3 mL酶液利用比色法進(jìn)行測定。

1.2.4 優(yōu)良菌種鑒定

（1）液體菌種的制備

將80 mL cPDA液體培養(yǎng)基裝入250 mL三角瓶中，121℃滅菌 30 min。

冷卻后接入適齡的斜面菌絲片段，25℃靜止培養(yǎng)2 d~3 d，然后在130 r·min-1搖床培養(yǎng) 3 d~5 d。

（2） DNA的提取

黑木耳液體菌種擴(kuò)培后，收集0.1 g菌絲體置于液氮中研磨，之后采用CTAB法提取基因組DNA并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，具體過程按賈定洪等的方法進(jìn)行[8]。

（3） ITS序列的PCR擴(kuò)增

ITS序列采用真菌通用引物[9]ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和 ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物由上海Sangon公司合成，擴(kuò)增在Biometra T1 Thermocycler PCR儀上進(jìn)行，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，然后用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收。

（4） ITS片段的克隆

將PCR純化產(chǎn)物與PMD-18T Vector（Takara公司）連接后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞中，用含XGal、IPTG、Amp LB平板篩選，挑白色菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒做PCR檢測。

（5） 測序

電泳檢測陽性克隆成功后，將該管菌液送往測序北京生工測序公司進(jìn)行測序。

（6）系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將測得的優(yōu)良菌株的ITS序列在GenBank上進(jìn)行BLAST分析，利用軟件Clustal X進(jìn)行同源性比較，利用MEGA4軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 初篩結(jié)果

將20株菌株接種在PDA斜面試管和PDA培養(yǎng)皿上，其生長情況與對照菌株的生長情況進(jìn)行比較，結(jié)果有8株因與對照菌株相比生長速度慢、長勢弱而被淘汰。

拮抗實(shí)驗(yàn)是為了檢測各菌株間是否為獨(dú)立的菌株，淘汰那些編號不同但基因型相同的菌株，結(jié)果有4株菌株因無拮抗現(xiàn)象發(fā)生而被淘汰。

2.2 復(fù)篩結(jié)果

實(shí)驗(yàn)菌株與對照菌株在各級培養(yǎng)基上的生長速度情況見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)菌株與對照菌株在各級培養(yǎng)基上的生長速度

由表1可知，菌株6號、7號生長旺盛，菌絲粗壯、潔白。纖維素酶活力比較情況見表2。

表2 纖維素酶活力比較

由表2可知，X6菌株的纖維素酶活力居參試菌株和對照菌株之首。自然條件下三級菌抗污染能力及產(chǎn)量情況見表3。

由表3可知，6號菌株產(chǎn)量達(dá)到48 g·袋-1，高于其他試驗(yàn)菌株與對照菌株。雜菌率方面除2號和7號菌株與對照菌株中黑29持平外，其他試驗(yàn)菌株的雜菌率都低于對照菌株。商品性能分析見表4。

通過對各菌株商品性能的比較分析可知，4號、6號、7號、14號和17號菌株大多呈片狀或者碗狀，表現(xiàn)為小根且易開片。

綜合以上各指標(biāo)可確定西藏6號，為優(yōu)良菌株，結(jié)果見圖1。

2.3 鑒定結(jié)果

表3 自然條件下三級菌抗污染能力及產(chǎn)量

表4 商品性能分析

圖1 X6菌株子實(shí)體與三級菌菌袋

用CTAB法提取黑木耳液體菌種基因組DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果見圖2。

圖2 電泳檢測結(jié)果

由圖2可知，提取的DNA條帶清晰，b、c沒有明顯的拖尾現(xiàn)象，說明DNA無蛋白質(zhì)及RNA污染，完整性較好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。18Sr DNA PCR擴(kuò)增的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖3。

圖3 18Sr DNA的PCR擴(kuò)增的瓊脂糖凝膠電泳（1%）

由圖3可知，所獲得的電泳條帶600 bp左右，與預(yù)期結(jié)果一致。轉(zhuǎn)化子通用引物PCR鑒定結(jié)果見圖4。

圖4 轉(zhuǎn)化子通用引物PCR鑒定

由圖4可知，菌液均出現(xiàn)特異性條帶，可初步取定轉(zhuǎn)化子為陽性?；贗TS序列構(gòu)建的黑木耳屬系統(tǒng)發(fā)育樹見圖5。

圖5 基于ITS序列構(gòu)建的黑木耳屬系統(tǒng)發(fā)育樹

通過系統(tǒng)進(jìn)化樹可知，X6菌株與數(shù)據(jù)庫中的黑木耳菌株916為主的亞群處在同一分支上，因此可以確定被鑒定的優(yōu)良菌株X6與黑木耳菌株916同源性最大，同為木耳屬黑木耳種。

3 結(jié)論

本研究中供試材料均采自林芝地區(qū)境內(nèi)有野生黑木耳分布，且周邊無人工栽培黑木耳的深山，從而最大程度排除材料受人工栽培種質(zhì)漂移的可能性。通過對采集并且分離得到的20株優(yōu)良野生黑木耳菌株，進(jìn)行常規(guī)的菌種篩選研究，最終篩選出了優(yōu)良菌株X6，其在菌絲生長速度、長勢、抗雜能力等方面均優(yōu)于其他菌株與對照菌株。

本研究采用rDNA-ITS序列對所得優(yōu)良菌株進(jìn)行分子鑒定，因?yàn)樵撔蛄凶儺愝^快，可提供比較豐富的變異位點(diǎn)和信息位點(diǎn)，因此可作為一種分子標(biāo)記用于探討真菌種內(nèi)變異和屬內(nèi)種間分子系統(tǒng)關(guān)系[10，11]。近年來鑒于ITS序列方便、快速的特點(diǎn)，因此經(jīng)常用于鑒定一些未知植株，如侯軍利用ITS序列對疑似菌株白羊肚菌進(jìn)行了初步分子鑒定[12]。本試驗(yàn)對所篩選得到的X6菌株，進(jìn)行鑒定的結(jié)果顯示，X6菌株與數(shù)據(jù)庫中的黑木耳916菌株處于同一分支，由此可斷定X6菌株為木耳屬黑木耳種。

明確了X6菌株的優(yōu)良性能及其種屬關(guān)系后，建議該菌種可作為林芝地區(qū)人工袋料栽培黑木耳的母種進(jìn)行推廣使用。

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