轉(zhuǎn)TCS基因泡桐對(duì)土壤微生物的影響1)

高尚坤

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，泰安，271018)

劉 靜 黃艷艷 羅 磊 馮殿齊

(泰安市泰山林業(yè)科學(xué)研究院)

劉玉升 牛慶霖

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué))

自 1983 年轉(zhuǎn)基因植物［1－2］首次問(wèn)世以來(lái)，轉(zhuǎn)基因植物的開發(fā)與應(yīng)用得到了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。但轉(zhuǎn)基因作物的大面積種植極有可能對(duì)農(nóng)林生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生多方面的危害。因此，對(duì)其釋放后的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)極為必要。目前，有關(guān)轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的生物安全研究較多，其中主要涉及對(duì)非目標(biāo)昆蟲、農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)影響以及基因漂移等，如對(duì)轉(zhuǎn)基因的棉花［3－9］、水稻［10］、煙草［11］、枸杞［12］等農(nóng)作物和經(jīng)濟(jì)作物對(duì)土壤微生物生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)有大量研究，但在轉(zhuǎn)基因林木方面的報(bào)道很少［13］。林木轉(zhuǎn)基因生物安全性主要包括轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定性、外源基因向天然群體的基因漂移及對(duì)非目標(biāo)生物的影響等［14］。

土壤微生物的多樣性是保持農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定的基礎(chǔ)。微生物普遍存在于土壤中，對(duì)環(huán)境條件的變化反應(yīng)敏捷，它能較早地預(yù)測(cè)土壤養(yǎng)分及環(huán)境質(zhì)量的變化過(guò)程，被認(rèn)為是最有潛力的敏感性生物指標(biāo)之一。研究表明，轉(zhuǎn)基因作物的外源基因和基因表達(dá)產(chǎn)物可通過(guò)根系分泌物或殘茬進(jìn)入土壤生態(tài)系統(tǒng)，進(jìn)而對(duì)土壤微生物多樣性造成影響。土壤中的微生物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)系統(tǒng)中具有其他生物無(wú)法代替的作用，隨著各種抗蟲、抗病等轉(zhuǎn)基因作物的不斷選育種植，這種變化對(duì)土壤微生物存在潛在危險(xiǎn)而可能造成對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)系統(tǒng)的影響［15－20］。

泡桐［Paulownia fortunei(seem.)Hemsi］為玄參科泡桐屬植物，原產(chǎn)我國(guó)，現(xiàn)分布于世界各地。因材質(zhì)優(yōu)良，速生豐產(chǎn)，從而成為重要的用材樹種和綠化樹種，廣泛用于建筑、樂(lè)器和工藝品的制作以及園林綠化［21］。但由于泡桐叢枝病嚴(yán)重影響了畸形、幼苗枯死、大樹生長(zhǎng)緩慢，給泡桐生產(chǎn)造成了很大的影響，嚴(yán)重打擊了農(nóng)民種植泡桐的積極性。經(jīng)研究通過(guò)轉(zhuǎn)抗叢枝病TCS基因進(jìn)行該病的控制，并成功獲得了轉(zhuǎn)基因株系，經(jīng)多年試驗(yàn)，該株系表現(xiàn)良好，為更快、更安全地進(jìn)行示范推廣，本文采用平板培養(yǎng)法分析了轉(zhuǎn)基因泡桐對(duì)根際土壤微生物群落數(shù)量的影響，并系統(tǒng)的研究了細(xì)菌菌群，為轉(zhuǎn)基因泡桐環(huán)境釋放后對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響提供了依據(jù)。

1 試驗(yàn)地概況

轉(zhuǎn)抗病TCS基因泡桐位于菏澤市定陶縣孟海鎮(zhèn)牛屯試驗(yàn)地，面積約667 m2，為黃河沖擊平原，北緯32°41″，東經(jīng)115°36″;年平均氣溫 10.1 ℃，月平均最高溫度25.6℃，最低1月份－0.7℃;全年日照時(shí)數(shù) 2035.5 h，年降水量 250.4 mm;砂壤土，pH 值7.8。試驗(yàn)地周圍是農(nóng)田及行道樹107黑楊。

2 材料與方法

供試材料來(lái)源于試驗(yàn)田中的轉(zhuǎn)基因株系、非轉(zhuǎn)基因株系和非根際土壤(對(duì)照組);每個(gè)組分別采集3個(gè)單株土樣，各單株樹齡相當(dāng)，田間管理一致。

培養(yǎng)基為:牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱NA培養(yǎng)基)、馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱PDA培養(yǎng)基)、高氏1號(hào)培養(yǎng)基。

土壤取樣方法:采用3點(diǎn)取樣法。從轉(zhuǎn)基因泡桐和非轉(zhuǎn)基因泡桐試驗(yàn)地根際周圍采集土樣;采集時(shí)除去地面植被和枯枝落葉，鏟除表面1 cm左右的表土，用取樣器取離地表10 cm左右的土樣;剔除雜物，轉(zhuǎn)入干凈的保鮮袋中帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行測(cè)定。

土壤微生物種類測(cè)定:采用稀釋平板法測(cè)定土壤微生物的數(shù)量與種類。具體操作方法:①對(duì)于采集的土樣，用1/1000天平準(zhǔn)確稱取10 g后加入盛有90 mL無(wú)菌水的三角瓶中，在振蕩器上振蕩30 min，使土樣均勻分散，得到質(zhì)量濃度為10－1g/mL土壤懸濁液。②充分渦旋后立即吸取1 mL懸濁液加至盛有9 mL無(wú)菌水的試管中，得到質(zhì)量濃度為10－2g/mL懸濁液。按照此方法，依次將土壤懸濁液稀釋，細(xì)菌測(cè)試時(shí)將土壤懸濁液稀釋至 10－5、10－6、10－7g/mL、真菌測(cè)試時(shí)將土壤懸濁液稀釋至 10－2、10－3、10－4g/mL、放線菌測(cè)試時(shí)將土壤懸濁液稀釋至10－4、10－5、10－6g/mL。③細(xì)菌的分離、培養(yǎng)采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱NA培養(yǎng)基)，真菌的分離、培養(yǎng)采用馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱PDA培養(yǎng)基)，放線菌的分離、培養(yǎng)采用高氏1號(hào)培養(yǎng)基。④細(xì)菌的分離與純化時(shí)取土壤懸濁液質(zhì)量濃度為10－5、10－6、10－7三個(gè)稀釋度，真菌的分離與純化時(shí)取土壤懸濁液質(zhì)量濃度為 10－2、10－3、10－4三個(gè)稀釋度，放線菌的分離與純化時(shí)取土壤懸濁液質(zhì)量濃度為 10－4、10－5、10－6三個(gè)稀釋度;并且各吸取 0.2 mL至預(yù)先制備好的平板培養(yǎng)基上，用涂布法進(jìn)行分離，各稀釋度重復(fù)3次，分別置于30℃的GXZ型智能光照培養(yǎng)箱和YQX型厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。對(duì)于細(xì)菌，挑取表征各異的菌落，在NA劃線、純化，將純化后的菌落分別劃NA培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)，并依次編號(hào);對(duì)于真菌和放線菌，根據(jù)菌株的培養(yǎng)性狀，結(jié)合顯微鏡觀察，對(duì)菌株依次編號(hào)。

土壤微生物的數(shù)量測(cè)定:對(duì)已編號(hào)的真菌和放線菌，進(jìn)行培養(yǎng)性狀觀察，采用刮板接種法計(jì)數(shù)。每毫升土壤懸浮液中菌落數(shù)=(菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×20)/干土的百分?jǐn)?shù)，所用數(shù)據(jù)用 Microsoft Excel 2003進(jìn)行處理，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

無(wú)菌條件下，將土壤細(xì)菌懸浮液按不同比例稀釋，取質(zhì)量濃度為 10－5、10－6、10－7g/mL 三個(gè)稀釋度的定量懸浮液，分別在NA培養(yǎng)基平板上涂抹，30℃培養(yǎng)72 h。選取菌落稀疏適當(dāng)?shù)钠桨逵?jì)算細(xì)菌菌落數(shù)，并求取3個(gè)重復(fù)的平均值，計(jì)算出每克或毫克土壤懸浮液中的細(xì)菌數(shù)。每毫升懸浮液內(nèi)細(xì)菌數(shù)≈(平板菌落數(shù)×土壤懸濁液質(zhì)量濃度)/平板加液量。所用數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2003進(jìn)行處理，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

土壤真菌和放線菌的種群鑒定:通過(guò)對(duì)真菌菌落的大小、形態(tài)、色素、顏色和質(zhì)地等形態(tài)進(jìn)行觀察，對(duì)3組土壤中真菌和放線菌種類進(jìn)行初步鑒定。

土壤中細(xì)菌的種群鑒定:對(duì)純化后已編號(hào)的各細(xì)菌菌株，進(jìn)行革蘭氏染色［22］、芽孢染色、鞭毛染色、生理生化測(cè)定等試驗(yàn)，并按《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第八版進(jìn)行鑒定［23－26］。

3 結(jié)果與分析

3.1 土壤中微生物數(shù)量

利用刮板接種法對(duì)不同土樣的真菌、放線菌菌落數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，同時(shí)利用平板菌落計(jì)數(shù)法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)(見表1)。由表1可以看出:與非根際土壤對(duì)比，轉(zhuǎn)基因泡桐根際的微生物類群沒有發(fā)生變化，以細(xì)菌為主要微生物群，其次是真菌和放線菌。從不同土樣微生物數(shù)量看出，以轉(zhuǎn)基因細(xì)菌群落的數(shù)量最大，其次是真菌和放線菌。

表1 土壤微生物群落計(jì)數(shù) 個(gè)·mL－1

3.2 土壤中真菌和放線菌的種群鑒定

通過(guò)對(duì)真菌菌落的大小、形態(tài)、色素、顏色和質(zhì)地等形態(tài)進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，3組土壤中真菌種類相同，主要為毛霉屬(Mucor)和根霉屬(Rhizopus)。種群數(shù)量，毛霉屬為 1.0×103個(gè)/mL、根霉屬為 2.0×103個(gè)/mL;3組土壤中均發(fā)現(xiàn)一種放線菌，其種群數(shù)量為2.0×103個(gè)/mL。

3.3 土壤中細(xì)菌的種群鑒定

對(duì)土壤細(xì)菌進(jìn)一步分離、純化及培養(yǎng)觀察，共有18個(gè)細(xì)菌菌株，其中從轉(zhuǎn)基因株系組、非轉(zhuǎn)基因株系組、對(duì)照組中均獲得6個(gè)細(xì)菌菌株;經(jīng)培養(yǎng)性狀比較，相同菌株保留一株，經(jīng)整理統(tǒng)一編號(hào)后，分別編號(hào)為1～6號(hào)、1～3號(hào)和1～2號(hào)。

3.3.1 供試菌株菌體形態(tài)和培養(yǎng)性狀

將供試菌株在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h，按照革蘭氏染色法和3%KOH簡(jiǎn)易法，調(diào)查革蘭氏陰性反應(yīng)情況。經(jīng)油鏡和林鎢酸鈉復(fù)染法電鏡觀察菌體形態(tài)、鞭毛有無(wú)及部位、芽胞有無(wú)等性狀，將分離純化的供試菌株在NA和NB培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)48 h后觀察培養(yǎng)性狀(見表2)。從表2中可看出:轉(zhuǎn)基因株系組6個(gè)菌株菌體形態(tài)除3號(hào)為短桿型，其余均為長(zhǎng)桿型，革蘭氏染色均為陽(yáng)性;除5號(hào)周生鞭毛外，其余均無(wú)周鞭毛生長(zhǎng);3號(hào)菌無(wú)芽胞生長(zhǎng)，其余均有芽胞生長(zhǎng)。非轉(zhuǎn)基因株系組中的1號(hào)為短桿型;2號(hào)、3號(hào)菌株為周生鞭毛。非根際土壤中，1號(hào)為短桿型，2號(hào)為長(zhǎng)桿型，均無(wú)周生鞭毛。由此得出:3個(gè)樣品菌種發(fā)生了變化。

表2 土壤細(xì)菌的形態(tài)特征及培養(yǎng)性狀

3.3.2 供試細(xì)菌菌株生理性狀

將供試細(xì)菌菌株在不同溫度、不同pH值和不同NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下，接種培養(yǎng)不同時(shí)間，觀察生理性狀(見表3)。從表3中可知:供試菌株在不同溫度、不同pH值和不同NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)下培養(yǎng)，轉(zhuǎn)基因株系組中的1號(hào)和3號(hào)、非轉(zhuǎn)基因株系組中的3號(hào)和對(duì)照組的2號(hào)，可在15℃下生長(zhǎng);所有菌株在30～37℃條件下、在pH值5～9條件下、在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)2% ～7%條件下，均生長(zhǎng)良好。

表3 土壤細(xì)菌的生理性狀

3.3.3 供試菌株生化性狀

對(duì)供試11個(gè)菌株生化性狀測(cè)定:氧化酶等4種，6種氮素化合物和糖醇以及其他碳素化合物19種(見表4)。從表4可知:供試11個(gè)菌株，除賴氨酸脫羧酶非轉(zhuǎn)基因株系組中的2號(hào)菌株陰性，其他菌株均為陽(yáng)性;過(guò)氧化氫酶、吲哚和鳥氨酸脫羧酶為陽(yáng)性;除轉(zhuǎn)基因株系組中的1號(hào)菌株不能使明膠液化，其他菌株均可以;除轉(zhuǎn)基因株系組中的1號(hào)菌株能利用麥芽糖和棉籽糖外，其他糖醇均不能利用;發(fā)現(xiàn)各組各菌株其他生化測(cè)定項(xiàng)目各異。

表4 土壤細(xì)菌生化測(cè)定結(jié)果

表4 (續(xù))

3.3.4 細(xì)菌菌株鑒定及其存在數(shù)量狀況

經(jīng)對(duì)應(yīng)和檢查菌體形態(tài)、染色反應(yīng)、培養(yǎng)性狀、生理生化反應(yīng)等各項(xiàng)指標(biāo)，綜合鑒定結(jié)果見表5。由表5可見，①轉(zhuǎn)基因株系組的6個(gè)菌株及數(shù)量，分別為:嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)60×106個(gè)/mL、環(huán)狀芽孢桿菌(B.circulans)30×106個(gè)/mL、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter sp.)15×106個(gè)/mL、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(B.firmus)3×106個(gè)/mL、蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)1×106個(gè)/mL、短小芽孢桿菌(B.pumilus)均為1×106個(gè)/mL。②非轉(zhuǎn)基因株系組的6個(gè)菌株及數(shù)量，分別為:短小芽孢桿菌(B.pumilus)1×106個(gè)/mL、蜜蜂芽孢桿(B.bee)3×106個(gè)/mL、嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)1×106個(gè)/mL、球形芽孢桿菌(B.sphaericus)2×106個(gè)/mL、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(B.firmus)1×106個(gè)/mL、蜂房芽孢桿菌(B.hive)3×106個(gè)/mL。③對(duì)照組(非根際土壤)的6個(gè)菌株及數(shù)量，分別為:嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)5×105個(gè)/mL、球形芽孢桿菌(B.sphaericus)1×105個(gè)/mL、環(huán)狀芽孢桿菌(B.circulans)4×105個(gè)/mL、蜂房芽孢桿菌(B.hive)2×105個(gè)/mL、短小芽孢桿菌(B.pumilus)為 1×105個(gè)/mL、浸麻芽孢桿菌(B.macerans)7×105個(gè)/mL。綜合以上結(jié)果可見:轉(zhuǎn)基因泡桐根際土壤與對(duì)照相比細(xì)菌種類及數(shù)量明顯增多，真菌和放線菌種類和數(shù)量沒有發(fā)生很大變化;真菌菌群中以毛霉屬和根霉屬為主，細(xì)菌菌群中以芽孢桿菌屬為主，但對(duì)土壤微生物的多樣性無(wú)影響。

表5 土壤細(xì)菌鑒定結(jié)果、分布情況及數(shù)量

4 結(jié)論與討論

在細(xì)菌種類上:除在轉(zhuǎn)基因株系根際土壤中存在檸檬酸桿菌屬外，其余菌株均屬于芽孢桿菌屬。其中嗜熱脂肪芽孢桿菌在轉(zhuǎn)基因株系、非轉(zhuǎn)基因株系和非根際土壤中均分離得到;球形芽孢桿菌和蜂房芽孢桿菌，只在非轉(zhuǎn)基因株系和非根際土壤中分離得到;環(huán)狀芽孢桿菌，只在轉(zhuǎn)基因株系和非根際土壤中分離得到;堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌，在非根際土壤中沒有分離得到，在其他兩個(gè)株系根際周圍分離得到;球形芽孢桿菌和蜂房芽孢桿菌，在非轉(zhuǎn)基因株系和非根際土壤中均分離得到，在轉(zhuǎn)基因株系中均未分離到。

在細(xì)菌數(shù)量上:轉(zhuǎn)基因株系根際土壤中的細(xì)菌數(shù)量為1.10×108個(gè)/mL，非轉(zhuǎn)基因株系根際土壤中的細(xì)菌數(shù)量為1.1×107個(gè)/mL，非根際土壤中的細(xì)菌數(shù)量為2.0×106個(gè)/mL，表明轉(zhuǎn)基因后細(xì)菌數(shù)量明顯增加。

結(jié)果表明:轉(zhuǎn)基因泡桐根圍的土壤微生物數(shù)量都有變化，其中細(xì)菌菌群數(shù)量變化最大，但轉(zhuǎn)基因泡桐根圍土壤微生物的總體構(gòu)成變化不大，仍以細(xì)菌數(shù)量最多，真菌和放線菌次之;在細(xì)菌菌群中，以芽孢桿菌屬的細(xì)菌為主。說(shuō)明轉(zhuǎn)基因泡桐對(duì)土壤微生物的數(shù)量有一定影響，但對(duì)土壤微生物的多樣性無(wú)影響。

本研究是通過(guò)稀釋平板法進(jìn)行土壤微生物的分離測(cè)定，現(xiàn)今把分子生物學(xué)技術(shù)運(yùn)用于土壤微生物生態(tài)學(xué)，可以避開傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)過(guò)程，通過(guò)DNA水平上的研究，直接探討土壤微生物的種群結(jié)構(gòu)及其與環(huán)境的關(guān)系。而且可結(jié)合16S rDNA序列分析研究原核微生物群落多樣性技術(shù)，更為精確地揭示土壤中微生物種群結(jié)構(gòu)及其動(dòng)態(tài)變化［27－29］。

另外，本文只對(duì)秋季落葉后轉(zhuǎn)基因株系、非轉(zhuǎn)基因株系根際土壤和非根際土壤微生物群落進(jìn)行了研究，對(duì)于不同的季節(jié)的土壤微生物群落變化及相同季節(jié)的土壤微生物群落穩(wěn)定性差異，有待進(jìn)一步研究。

轉(zhuǎn)抗病TCS基因泡桐可以有效減輕泡桐叢枝病的發(fā)生，降低泡桐經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益損失，有利于林業(yè)可持續(xù)生態(tài)系統(tǒng)的建立，對(duì)于其他林果木叢枝病(如棗瘋病)的防治具有重大指導(dǎo)意義。因此，對(duì)于轉(zhuǎn)抗病TCS基因泡桐的安全釋放問(wèn)題需進(jìn)一步跟進(jìn)和完善。

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