取材時期對文冠果優(yōu)樹芽啟動的影響1)

王 非 孫赟璐

(東北林業(yè)大學，哈爾濱，150040)

李在善

(韓國江原大學山林環(huán)境科學學院)

李玉花 李風日 李成德 由香玲

(東北林業(yè)大學)

文冠果(Xanthoceras sorbifolia Bunge)又名木瓜、文燈果等，屬無患子科文冠果屬，獨屬獨種。文冠果不僅樹形美觀，而且種子含油量達30% ～60%，是北方優(yōu)良的觀賞兼木本油料樹種［1］。與其他果樹相比，文冠果組織培養(yǎng)再生植株較困難。盡管研究者進行了大量研究工作［2-4］，但目前文冠果的組織培養(yǎng)技術仍處于初級水平［1］，還有大量問題需要解決。芽芽繁殖是最能保持母本優(yōu)良特性的一種無性繁殖方式。早在1980年，張桂琴等以文冠果嫩莖為材料誘導出了腋芽，提出了其最適離體培養(yǎng)條件［5］。此后，王永明等、王玉珍等也提出了以文冠果側芽萌發(fā)的最適培養(yǎng)條件［6-7］。然而他們對外植體材料的接種時期幾乎沒有闡述，僅大致描述了材料的狀態(tài)，如，張桂琴等僅描述了3～7年生的嫩莖和半木質化枝條，王永明等也只說到利用帶腋芽的嫩莖段為外植體。這致使他們的研究結論差異較大，也限制了這些結論的實際應用。筆者在上述研究的基礎上，主要探討組織培養(yǎng)不同取材時間的外植體芽(頂芽和腋芽)的啟動和生長情況，確定相對準確的芽培養(yǎng)取材時間和狀態(tài)，從而為文冠果芽培養(yǎng)技術的完善提供一部分內(nèi)容。

1 材料與方法

1.1 材料來源及取材時間

本研究所用材料來自于黑龍江省安達市人民公園內(nèi)的約7～10年生文冠果優(yōu)樹。2010年分別于5月10日、6月10日、7月10日取材。5月10日，由于氣溫較低，新枝還未抽出，所取外植體為頂芽。6月10和7月10日，所取材料為新抽嫩枝的腋芽。

1.2 頂芽和腋芽的萌發(fā)接種

外植體消毒:對所取外植體，即文冠果包含頂芽的主枝(長度約為2 cm)及新抽枝條進行同樣的消毒處理。先放在飽和洗衣粉水溶液中沖洗，用流水沖洗2～3 h后置于超凈工作臺上，用75%的酒精消毒30 s，無菌水沖洗 3次，再用 5%次氯酸鈉(HClO3)溶液消毒15～20 min，無菌水沖洗3次，倒在無菌培養(yǎng)皿內(nèi)(墊有無菌濾紙)，準備接種。

外植體接種:對頂芽外植體，首先剪去主枝，剝?nèi)ロ斞客獠亏[片和小葉，取出小芽接種在含有3%蔗糖和不同質量濃度BA(0～2.0 mg/L)和NAA(0～0.5 mg/L)的MS培養(yǎng)基中光培養(yǎng)誘導頂芽萌發(fā)。對腋芽外植體，將其切成1.0～1.5 cm長的莖段，接種于含有不同質量濃度BA和NAA培養(yǎng)基中光培養(yǎng)誘導腋芽萌發(fā)。

每個含有約40 mL培養(yǎng)基的100 mL容量玻璃三角瓶中接種3、4個上述外植體，不同BA和NAA質量濃度組合處理接種30瓶。

芽萌發(fā)數(shù)據(jù)用SPSS1310統(tǒng)計軟件進行差異顯著性多重(Duncan)分析。

1.3 萌發(fā)芽的繼代培養(yǎng)

頂芽或腋芽萌發(fā)后，將其切下繼代在萌發(fā)較好的培養(yǎng)基中，觀察并統(tǒng)計萌發(fā)芽的生長情況。

1.4 萌發(fā)芽的生根

選取上述生長較整齊一致的芽，切取2.5 cm，接種在含 IBA(0.4 ～ 1.0 mg/L)、NAA(0.2 ～ 0.4 mg/L)和2%蔗糖的1/2 MS培養(yǎng)基中誘導生根。4周后統(tǒng)計生根情況。

1.5 培養(yǎng)條件

本試驗所用培養(yǎng)均調(diào)整pH值為5.8后，在121℃、1.0～1.5個大氣壓之間滅菌15 min后用于接種。培養(yǎng)室的溫度為(23±2)℃，光照由白色日光燈提供，光照時間為白天16h，晚上8h，光照強度為1500～2000 lx。

2 結果與分析

2.1 不同取材時間對芽萌發(fā)的影響

5月10日由于東北的氣溫較低，頂芽還未萌發(fā)(如圖1A)。接種過程發(fā)現(xiàn)所取材料中有約60%頂芽是花芽(圖1B箭頭所示)。因此，該時期取材會對文冠果未來的果實造成不利影響。6月10日和7月10日接種的腋芽，在培養(yǎng)過程中都發(fā)現(xiàn)了一個顯著的特點，即大約7～10 d，在接種的葉柄基部(如圖1F、圖1G中箭頭所示)接種的腋芽萌發(fā)較快。

培養(yǎng)3周后，統(tǒng)計3個取材時間頂芽、腋芽的萌發(fā)情況(如表1)?？梢钥闯?月10日(圖1B、圖1C)和6月10日(圖1D、圖1E)取材的頂芽和腋芽在不同植物生長調(diào)節(jié)劑作用下都有不同程度的萌發(fā)，而7月10日所取材都沒有萌發(fā)(如圖1G、圖1H)。5月份取材比6月份取材，芽的萌發(fā)率更高。同時，芽的萌發(fā)與培養(yǎng)基中植物生長調(diào)節(jié)劑的種類和質量濃度有關，5月份取材的外植體在BA0.1 mg/L和 BA0.5 mg/L+NAA0.2 mg/L 的條件下，芽的萌發(fā)率分別為88.4%和88.2%，相差不顯著;但萌發(fā)芽的生長狀況差異顯著，分別為2.5和2.0 cm。6月份取材的外植體在BA0.5 mg/L+NAA0.2 mg/L的條件下，芽的萌發(fā)率相對比其他植物生長素條件下的高，約51.3%，萌發(fā)芽高為1.5 cm。

圖1 不同時期所取文冠果芽的萌發(fā)、生長及生根

2.2 萌發(fā)芽的繼代

上述萌發(fā)芽切割下來，按照月份接種到含有BA和NAA的培養(yǎng)條件下進行繼代培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，芽切割下來很容易玻璃化，繼而死亡。培養(yǎng)4周后的繼代萌發(fā)芽的存活率統(tǒng)計如表2。可見，5、6月份取材獲得的芽主要在兩種培養(yǎng)條件下(BA0.5 mg/L+NAA0.2 mg/L，BA1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L)能存活下來，分別為:70.3%，27.5%，69.5%，20.8%，芽的存活率相差不大;繼代較好的培養(yǎng)基條件為BA0.5 mg/L+NAA0.2 mg/L。

表1 不同時期所取外植體在含有不同質量濃度BA和NAA的MS培養(yǎng)基培養(yǎng)3周后的萌發(fā)

表2 不同時間取材萌發(fā)芽繼代培養(yǎng)4周的存活情況

2.3 萌發(fā)芽的生根

將萌發(fā)芽接種到含有IBA和NAA的生根培養(yǎng)基中誘導生根。培養(yǎng)4周后的生根情況統(tǒng)計如表3?？梢?，生根率都不高，最高的為24%，其培養(yǎng)條件為 IBA0.8 mg/L+NAA0.4 mg/L。

文冠果生根較困難，本研究中文冠果生根的幾種植物生長調(diào)節(jié)劑配比是查閱了相關的資料確定的。其中關于IBA1.0 mg/L主要參考了王永明等提出的誘導文冠果生根的培養(yǎng)基條件(MS大量元素減半，附加IBA1.0mg/L、蔗糖1.5% 、瓊脂均為0.8%，pH 值為 5.8 ～ 6.2［6］，但并未獲得理想的結果，生根率只有12%，可能由不定芽的狀態(tài)、試驗條件的差異引起的。本研究中的其他生根條件主要來自程冉試驗提出的文冠果生根最佳培養(yǎng)基(MS+IAA1.0 ～ 2.0 mg/L)［8］，但生根率都不高。其他獲得理想生根的還有張桂琴等和王玉珍等的研究結果。張桂琴等經(jīng)實驗研究提出文冠果生根的最佳培養(yǎng)基是在 SH培養(yǎng)基上附加 IBA1.5 mg/L、IAA1.0 mg/L，或在MS培養(yǎng)基上附加H培養(yǎng)基的葉酸、生物素等［5］。在轉接之前，先將小苗基部切口以上0.3 cm處在酒精IBA溶液(用95%酒精配制成含0.1%IBA的溶液)中速浸幾秒鐘。經(jīng)約半個月根即伸長;根系粗壯，側根多，發(fā)根率能達83%。王玉珍等在文冠果組培快繁專利中提出的文冠果最佳生根培養(yǎng)基為:在1/2 MS培養(yǎng)基中添加 IBA0.25～2.0 mg/L，NAA0.5 ～3.0 mg/L，AC0.5 ～ 1.0 mg/L，食用糖15～20 g/L［2］。由于組織培養(yǎng)過程中其他一些微環(huán)境和個人操作的差異，同樣研究內(nèi)容在不同的實驗室、同一實驗室不同操作人之間的結果往往差異很大。由于本試驗的材料有限，報道的一些理想生根條件還需要進一步驗證和研究。

表3 芽在含有IBA和NAA的1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)4周的生根情況

3 討論

組織培養(yǎng)中外植體狀態(tài)是培養(yǎng)成敗的最關鍵因素。腋芽和頂芽是離體無性繁殖經(jīng)常利用的一種材料，由于室外的季節(jié)和溫度變化，適合組織培養(yǎng)的芽的狀態(tài)應該是在春天芽開始萌動和剛剛萌發(fā)的時候，研究結果也顯示了頂芽的萌發(fā)和生長優(yōu)勢。在5月初，哈爾濱地區(qū)氣溫已經(jīng)開始升高，文冠果樹木開始萌發(fā)，應該是取材的最佳時期。但由于文冠果頂芽中有很大一部分是花芽，而此時從外觀上無法區(qū)分花芽和腋芽，考慮到此時取材會對母樹起破壞作用，所以不建議該時期取材。6、7月份進行的研究，材料都是半木質化的嫩莖，但腋芽萌發(fā)差異顯著，可能是隨著時間的延長，半木質化程度、次生物質的積累等存在差異。

對于腋芽的繼代和增殖，到目前還沒有查到理想結果的報道，僅嘗試了其繼代培養(yǎng)的條件，其高效增殖還需進一步研究。

［1］張娜，郭進平.文冠果組織培養(yǎng)技術關鍵環(huán)節(jié)研究進展與展望［J］.中國農(nóng)學通訊，2009，25(8):113-116

［2］顧玉紅，高述民，郭惠紅，等.文冠果的體細胞胚發(fā)生［J］.植物生理學通訊，2004，40(3):311-313.

［3］顧玉紅.文冠果體細胞胚胎發(fā)生及形態(tài)建成機理的研究［D］.北京:北京林業(yè)大學，2005:37-37.

［4］藏國忠，陳尚武，張文，等.文冠果子葉同不胚的高效誘導及植株再生［J］.西北林學院學報，2008，23(5):91-94.

［5］張桂琴，徐祥齡，趙志學.文冠果嫩莖組織誘導植株移栽初獲成功［J］.林業(yè)科技通訊，1980(7):4-5.

［6］王永明，趙靜茹，陳穎.文冠果的組織培養(yǎng)［J］.植物生理學通訊，1986(1):42-42.

［7］王玉珍，李霞，張弛.文冠果組培快速繁殖方法:中國，10103226［P］.2007-9-12.

［8］程冉.文冠果的引種、快繁及優(yōu)質豐產(chǎn)栽培技術體系研究［D］.泰安:山東農(nóng)業(yè)大學，2004:31-32.