• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    鵝膏菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)培養(yǎng)條件優(yōu)化及安全性分析1)

    2012-09-18 01:27:16冀瑞卿
    東北林業(yè)大學學報 2012年3期
    關(guān)鍵詞:乳糖生物量菌株

    冀瑞卿 李 玉

    (吉林農(nóng)業(yè)大學,長春,130018)

    宋瑞清

    (東北林業(yè)大學)

    鵝膏屬(Amanita)真菌隸屬于傘菌亞綱(Agaricomycetidae)、傘菌目(Agaricales)、鵝膏科(Amanitaceae)[1],其絕大多數(shù)是專性菌根菌,與松科、殼斗科、樺木科以及楊柳科的許多植物建立共生互惠的外生菌根關(guān)系[2]。鵝膏菌有很多是美味的食用菌,如:Amanita esculenta Hongo&Matsuda,橙蓋鵝膏菌(Amanita caesarea(Scop.:Fr.)Pers.ex Schw.)等[3],但是有毒鵝膏菌更引人關(guān)注。對于鵝膏菌有毒物質(zhì)及其毒理的研究頗受毒理學、化學、生物學和醫(yī)學等研究人員的重視,至今已有100多年的研究歷史。目前已分離鑒定的鵝膏菌毒素有多種[4-6]。將鵝膏菌的活性物質(zhì)用于有害生物的防治也有記載[7],如Amanita muscaria 就是因其對蒼蠅有毒而得名毒蠅鵝膏[8],鵝膏菌的抑菌物質(zhì)對病蟲害的防治效果也很顯著[9-11],然而在將其應用到實踐中與環(huán)境條件的適應性怎么樣?對環(huán)境能夠造成多大的影響等一系列的問題還需要更深入的研究,筆者就鵝膏菌菌株AV抑菌物質(zhì)的最佳營養(yǎng)條件和非營養(yǎng)條件、對溫度和紫外線的敏感問題,以及通過小鼠試驗對鵝膏菌菌株AV抑菌物質(zhì)對環(huán)境的安全性進行研究,保證其應用的生態(tài)安全性,在控制植物病原菌的同時不危害人類或其他生物的生長代謝,為其進一步的推廣奠定理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    試驗菌株:鵝膏菌菌株AV由東北林業(yè)大學病理教研室提供;試驗動物為昆明種小鼠,體質(zhì)量(19.15±0.15)g,雌、雄各半,購自黑龍江省腫瘤醫(yī)院動物試驗中心。

    試驗用培養(yǎng)基及其配方:①基礎(chǔ)培養(yǎng)基。葡萄糖 20.0 g,馬鈴薯 200.0 g,MgSO41.5 g,KH2PO43.0 g,瓊脂 20.0 g,水 1000.0 mL,自然 pH 值。②碳源培養(yǎng)基。各種碳源 20.0 g,蛋白胨 2.0 g,MgSO41.5 g,KH2PO43.0 g,水1000.0 mL,自然 pH 值。③氮源培養(yǎng)基。各種氮源 2.0 g,葡萄糖 20.0 g,MgSO41.5 g,KH2PO43.0 g,水1000.0 mL,自然 pH 值。④改良PD培養(yǎng)基。葡萄糖20.0 g,馬鈴薯200.0 g,MgSO41.5 g,KH2PO43.0 g,水1000 mL,自然 pH 值。

    培養(yǎng)方法:切取PDA平板培養(yǎng)7 d的同質(zhì)等量的菌片接種到盛有300 mL改良PD培養(yǎng)基的三角瓶(500 mL)中,置旋轉(zhuǎn)式搖床160 r/min、25℃培養(yǎng)15 d(小菌球布滿培養(yǎng)瓶)。按等濕重接種法接種,接含1 g濕菌球的二級種培養(yǎng)液到液體培養(yǎng)基中,設3個重復,搖床培養(yǎng)160 r/min、25℃、7 d。

    評價指標:①發(fā)酵液菌絲生物量。由菌絲干質(zhì)量確定。②抑菌物質(zhì)活性。將發(fā)酵液進行超聲波處理后,利用紫外—可見光分光光度計在226、218 nm下比色測定抑菌物質(zhì)活性[12],對照為相對應的液體培養(yǎng)基。

    試驗設計:①營養(yǎng)因子的單因子試驗。分別以各碳源或氮源培養(yǎng)基為培養(yǎng)基質(zhì),二級種為種子液,接種量為10%,裝液量為75%,pH自然。搖床培養(yǎng)160 r/min、25℃、7 d,收集菌絲,通過生物量和比色值確定最佳營養(yǎng)元素。②營養(yǎng)因子的正交試驗。5因子4水平的因子水平表設置如表1。以二級種為種子液,接種量均為10%,裝液量為75%,pH自然,搖床培養(yǎng)(160 r/min,25℃)7 d,收集菌絲,通過生物量和比色值確定營養(yǎng)元素間的影響作用。③不同環(huán)境因素的影響。以正交試驗確定的最佳培養(yǎng)基①為培養(yǎng)基,二級種為種子液,各影響因素的梯度設定如下:pH 為 4、5、6、7、8、9;裝液量為 30、50、75 mL;接種量為 0.75%、1.00%、1.25%;培養(yǎng)時間為 7、15、20 d;培養(yǎng)溫度為15、18、25、30、35、40 ℃;搖床轉(zhuǎn)速為 60、80、120、140、160、180 r/min,搖床培養(yǎng) 7 d,收集菌絲,通過生物量和比色值確定最佳培養(yǎng)條件。

    分離物Ⅳ[13]對環(huán)境的耐受性分析:①對溫度敏感性。分別在 25、35、45、55、65、75、85、100 ℃下處理分離物Ⅳ2 h,在226、218 nm下比色測定抑菌物質(zhì)活性。②對紫外光的敏感性。分離物Ⅳ在紫外燈下分別照射0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 h 后分別比色測定抑菌物質(zhì)活性。③對酸堿度的敏感性。分別用6 mol/L HCl和6 mol/L NaOH調(diào)酸堿度,使分離物Ⅳ的 pH 值為 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12,分別進行比色測定抑菌物質(zhì)活性。

    表1 鵝膏菌菌株AV培養(yǎng)因子的L16(45)正交試驗因素水平 g·L-1

    菌株AV抑菌物質(zhì)對環(huán)境中其他生物的影響:①小鼠急性毒性試驗。采用口服菌絲體方式飼喂小鼠。給藥前禁食16 h,不禁水。菌絲體分為4個劑量組(表7)。每劑量組飼喂10只小鼠。給藥后觀察小鼠的反應情況,記錄中毒癥狀和死亡情況;試驗之前作預試驗確定致死范圍。②小鼠異常毒性試驗。采用皮下注射的方式進行試驗,將菌株AV粗提液(分離物Ⅳ)冷凍干燥的粉末用無菌生理鹽水配制成質(zhì)量濃度為2 g/L的溶液備用。粗提液給藥質(zhì)量濃度為 0.06、1.00、2.00 g/L,分離物Ⅳ給藥質(zhì)量濃度為 0.02、0.06、0.10、1.00、2.00 g/L。給藥劑量為每只小鼠每天0.5 mL,每劑量組10只小鼠,觀察7 d,對照為正常飼喂小鼠。采用改進寇氏法[14]計算LD50。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 營養(yǎng)因子對抑菌活性的影響

    2.1.1 營養(yǎng)因子的單因子試驗

    不同碳源、氮源對生物量及抑菌活性的影響不同(表2)。菌株AV利用較好的碳源是乳糖、蔗糖和葡萄糖,在這3種碳源培養(yǎng)基中,菌絲體生物量間無顯著差異。從吸光度來看,以乳糖為碳源的提取液在226、218 nm下均最高。因此將乳糖作為菌株AV菌絲生長的最佳碳源。

    表2 營養(yǎng)元素對鵝膏菌菌株AV的生物量和抑菌物質(zhì)活性的影響

    從菌絲體生物量來看,乙酸銨、天門冬氨酸和蛋白胨是菌株AV生長利用很好的氮源;以蛋白胨為氮源的提取液在226、218 nm下的吸光度最大,即抑菌活性物質(zhì)的含量較高。因此將蛋白胨作為菌株AV菌絲生長的最佳氮源。

    2.1.2 營養(yǎng)因子的正交試驗

    由極差來看,對菌株AV生物量影響最大的是MgSO4的用量,其次是乳糖、KH2PO4、蛋白胨,但方差分析表明,4種營養(yǎng)元素對生物量影響結(jié)果在α=0.05下無顯著差異(表4)。而以抑菌活性物質(zhì)吸光度(226、218 nm)為衡量指標進行的正交分析顯示(表 3),影響因素由主到次是乳糖、MgSO4、KH2PO4、蛋白胨,方差分析結(jié)果(表4)表明4個因素中乳糖是影響菌株AV抑菌活性物質(zhì)含量的最重要因素,與其他的3個因素有顯著性差異(α=0.05),其他3個因素間無顯著差異。最佳組合為:①乳糖30.0 g/L,蛋 白 胨 0.50 g/L,MgSO41.5 g/L,KH2PO44.5 g/L;②乳糖 10.00 g/L,蛋白胨 0.50 g/L,MgSO40.75 g/L,KH2PO44.50 g/L;③乳糖30.0 g/L,蛋白胨 2.0 g/L,MgSO41.5 g/L,KH2PO43.0 g/L。

    表3 鵝膏菌菌株AV各營養(yǎng)因子正交試驗的直觀分析結(jié)果

    表4 鵝膏菌菌株AV各營養(yǎng)因子正交試驗的方差分析結(jié)果

    2.2 培養(yǎng)環(huán)境因子對抑菌活性的影響

    表5顯示了培養(yǎng)環(huán)境因子對于菌株AV菌絲生物量和抑菌活性物質(zhì)活性的影響情況。其生物量和抑菌物質(zhì)的含量最高的培養(yǎng)條件為:pH值5~6,溫度25℃,接種量1.25%,裝液量50%,搖床轉(zhuǎn)數(shù)180 r/min,培養(yǎng)時間 20 d。

    2.3 粗提物Ⅳ對于不同培養(yǎng)環(huán)境的耐受性

    由表6可見,溫度對菌株AV抑菌活性物質(zhì)活性影響較大。隨著溫度的升高,抑菌活性物質(zhì)活性降低。25~65℃對粗提物Ⅳ活性的影響比較小,之間無顯著性差異(α=0.01);溫度超過75℃時,菌株AV抑菌活性物質(zhì)活性急速下降,與前幾個溫度處理形成顯著差異;在100℃時,幾乎檢測不到活性。紫外照射對菌株AV抑菌活性物質(zhì)活性有一定的影響。

    表5 不同培養(yǎng)環(huán)境下鵝膏菌菌株AV的生物量和抑菌活性

    隨著照射時間的增加,抑菌物質(zhì)活性逐漸下降,紫外照射4 h以下對活性影響較小,4 h前的處理間無顯著差異(α=0.01),但4~8 h照射后活性下降比較快,其活性分別與前幾個照射時間的活性呈顯著差異(α=0.01)。pH值對菌株AV抑菌活性物質(zhì)活性影響較大。pH值6~7,抑菌活性物質(zhì)活性穩(wěn)定;pH<6(或者pH﹥7),隨著pH降低(或增加),抑菌活性物質(zhì)活性急速下降,之間形成顯著性差異(α=0.01);酸堿對抑菌物質(zhì)的活性都有影響,尤其是pH<5或者pH>5時活性下降更快。

    表6 不同環(huán)境因子對鵝膏菌菌株AV抑菌物質(zhì)活性的影響

    2.4 小鼠急性毒性分析

    用鵝膏菌菌株AV菌絲體飼喂小鼠LD50為418.70 mg/kg,95%可信限為 453.11 ~ 386.90 mg/kg。具體試驗結(jié)果見表7。

    表7 鵝膏菌菌株AV菌絲體的小鼠急性毒性試驗結(jié)果

    2.5 小鼠異常試驗結(jié)果

    前期抑菌試驗結(jié)果表明,粗提液及分離物Ⅳ抑菌效果最好的最高質(zhì)量濃度為0.06 g/L[13],將這個質(zhì)量濃度分別減小或加大對小鼠進行皮下注射試驗10 d,其質(zhì)量濃度加大到2 g/L也沒有危及小鼠生命,而且小鼠體質(zhì)量明顯增大。10 d后解剖結(jié)果表明:粗提液為2 g/L時,小鼠內(nèi)臟未發(fā)現(xiàn)異常;分離物Ⅳ2 g/L時,小鼠內(nèi)臟有異常變化(表8)。所以安全劑量應小于2 g/L。此質(zhì)量濃度比實際抑菌所用的高30多倍,因此,將鵝膏菌菌株AV抑菌活性物質(zhì)(粗提液或分離液Ⅳ)用于楊樹爛皮?。?3]的防治對生態(tài)安全。

    3 結(jié)論與討論

    通過最佳培養(yǎng)基及其最佳培養(yǎng)環(huán)境的選擇得到鵝膏菌菌株AV最適的培養(yǎng)條件:最佳碳源為乳糖,最佳氮源為蛋白胨,而且在供試的幾種營養(yǎng)元素中,碳源是影響菌株AV生物量及其抑菌物質(zhì)產(chǎn)生的最主要因素。最佳培養(yǎng)基組合為:①乳糖30.0 g/L,蛋白胨 0.5 g/L,MgSO41.5 g/L,KH2PO44.5 g/L;②乳糖10.00 g/L,蛋白胨 0.50 g/L,MgSO40.75 g/L,KH2PO44.50 g/L;③乳糖30.0 g/L,蛋白胨2.0 g/L,MgSO41.5 g/L,KH2PO43.0 g/L。產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)最適合培養(yǎng)條件為:pH值5~6,溫度25℃,接種量1.25%,裝液量50%,搖床轉(zhuǎn)數(shù)180 r/min,培養(yǎng)時間20 d。

    表8 鵝膏菌菌株AV粗提液和分離物Ⅳ對小鼠的影響

    比色測定時,226、218 nm下結(jié)果一致,抑菌物質(zhì)化學結(jié)構(gòu)還需更進一步試驗證明,但初步認為是酰胺類物質(zhì)[11],在水溶劑中發(fā)色團可能是烷基[12]。對極端環(huán)境的敏感性分析的結(jié)果顯示,分離物Ⅳ在環(huán)境中相對比較穩(wěn)定,但是在溫度超過75℃,pH大于9或小于4時,或者紫外照射時間超過4h會影響其抑菌物質(zhì)活性。正常的試驗條件下抑菌活性對溫度和光照的穩(wěn)定性比較好,對酸堿度比較敏感;但是從另一個角度考慮,在實踐應用中此物質(zhì)會不會造成高殘留對環(huán)境造成影響,還需進一步的深入研究。小鼠的毒性試驗結(jié)果表明,抑菌物質(zhì)質(zhì)量濃度在2 g/L以內(nèi)對小鼠無影響,可見在實際應用時控制抑菌物質(zhì)的質(zhì)量濃度非常重要。

    [1]Kirk P M,Cannon P F,Minter D W,et al.Ainsworth& bisby’s dictionary of the fungi[M].10 ed.Wallingford:CABI,2008:23.

    [2]楊祝良.中國真菌志:鵝膏科[M].北京:科學出版社,2005:1-20.

    [3]時有明,劉剛,周湘萍,等.紅黃鵝膏菌原亞種及其黃褐變種的傅里葉變換紅外光譜鑒別[J].光譜學與光譜分析,2009,29(2):389-392.

    [4]Splendiani G,Zazzaro D,Pietrantonio P D,et al.continuous renal replacement therapy and charcoal plasma perfusion in treatment of Amanita mushroom poisoning[J].Artificial Organs,2000,24(4):305-318.

    [5]Berger K J,Guss D A.Mycotoxins revisited:Part I[J].The Journal of Emergency Medicine,2005,28(1):53-62.

    [6]Stasyk T,Lutsik-Kordovsky M,Wernstedt C,et al.A new highly toxic protein isolated from the death cap Amanita phalloides is an lamino acid oxidase[J].FEBS Journal,2010,77(5):1260-1269.

    [7]陳芝蘭,何建清,孟霞,等.35種大型真菌的血凝活性測定[J].上海師范大學學報:自然科學版,2004,33(2):108-110.

    [8]Satora L,Pach D,Butryn B,et al.Fly agaric(Amanita muscaria)poisoning,case report and review[J].Toxicon,2005,45:941-943.

    [9]宋瑞清,冀瑞卿.四種毒蘑菇菌株及其毒素對楊樹爛皮病菌生長的抑制作用[J].北京林業(yè)大學學報,2005,27(2):88-91.

    [10]祁金玉,宋瑞清.毒蘑菇菌株及毒素粗提液對樟子松枯梢病菌生長的影響[J].林業(yè)科技,2006,31(3):20-23.

    [11]冀瑞卿,李玉,宋瑞清,等.Amanita virosa對楊樹爛皮病的抑制效果及其抑菌機理初探[J].中國森林病蟲,2010,29(6):1-4.

    [12]冀瑞卿,宋瑞清,孟黎瑩.高效菌株的篩選及其抑菌物質(zhì)的初分析[J].林業(yè)科技,2010,35(5):29-33.

    [13]冀瑞卿,李玉,孟黎鵬,等.鵝膏菌的抑菌作用及活性成分的FT-IR 分析[J].東北林業(yè)大學學報,2010,38(12):99-101.

    [14]孫敬芳.動物實驗方法學[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2001:258-380.

    猜你喜歡
    乳糖生物量菌株
    菌株ZYRH-19的篩選鑒定及其合成韋蘭膠的特性研究
    乳糖不耐受的人真的不能喝牛奶嗎
    灰樹花工廠化瓶栽菌株篩選試驗
    食用菌(2023年6期)2023-11-28 06:03:32
    菌株出馬讓畜禽污染物變廢為寶
    輪牧能有效促進高寒草地生物量和穩(wěn)定性
    號稱能告別“乳糖不耐受”的牛奶靠譜嗎?
    幸福(2018年33期)2018-12-05 05:22:48
    舒化奶能緩解乳糖不耐?
    舒化奶“終結(jié)”不了乳糖不耐癥
    飲食科學(2015年4期)2015-11-28 04:12:18
    生物量高的富鋅酵母的開發(fā)應用
    基于SPOT-5遙感影像估算玉米成熟期地上生物量及其碳氮累積量
    免费看不卡的av| 日韩在线高清观看一区二区三区| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲精品乱久久久久久| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 久久久成人免费电影| xxx大片免费视频| 国产精品爽爽va在线观看网站| 激情 狠狠 欧美| 免费电影在线观看免费观看| 神马国产精品三级电影在线观看| 深夜a级毛片| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 九九爱精品视频在线观看| 搡老乐熟女国产| 久久久久久久久大av| 岛国毛片在线播放| 免费观看av网站的网址| 汤姆久久久久久久影院中文字幕 | 淫秽高清视频在线观看| 丰满人妻一区二区三区视频av| 国产精品av视频在线免费观看| 日韩欧美三级三区| 亚洲精品色激情综合| av线在线观看网站| 亚洲成人久久爱视频| 成年版毛片免费区| 69人妻影院| 国产精品国产三级专区第一集| 精品酒店卫生间| 国产视频内射| 观看美女的网站| 日本与韩国留学比较| 一级毛片我不卡| 日本一本二区三区精品| 国产成人精品久久久久久| 午夜爱爱视频在线播放| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 亚洲精品久久午夜乱码| 内射极品少妇av片p| 日本爱情动作片www.在线观看| 网址你懂的国产日韩在线| 久久精品久久精品一区二区三区| 国内精品一区二区在线观看| 日韩伦理黄色片| 亚洲av日韩在线播放| 搞女人的毛片| 亚洲丝袜综合中文字幕| 黄色配什么色好看| .国产精品久久| 午夜免费观看性视频| 韩国高清视频一区二区三区| 最近手机中文字幕大全| 中文乱码字字幕精品一区二区三区 | 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 丝瓜视频免费看黄片| 97超碰精品成人国产| 国产在线男女| 国产伦一二天堂av在线观看| 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 国产视频内射| 可以在线观看毛片的网站| 夫妻性生交免费视频一级片| 亚洲av国产av综合av卡| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 五月玫瑰六月丁香| 国产亚洲5aaaaa淫片| 1000部很黄的大片| av.在线天堂| 女人久久www免费人成看片| 欧美人与善性xxx| 久久久久久九九精品二区国产| 精品国产三级普通话版| 日韩av免费高清视频| 国产成人精品婷婷| videossex国产| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 国产在线男女| 日本-黄色视频高清免费观看| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产精品女同一区二区软件| 国产精品一区www在线观看| 精品欧美国产一区二区三| 国产黄色小视频在线观看| 国产免费福利视频在线观看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 能在线免费观看的黄片| 毛片女人毛片| 最后的刺客免费高清国语| 一夜夜www| 国产 亚洲一区二区三区 | 天堂中文最新版在线下载 | 国产精品一及| 美女主播在线视频| 亚洲精品日韩av片在线观看| 国产精品无大码| 久久99精品国语久久久| 国产av在哪里看| 亚洲av国产av综合av卡| 免费看不卡的av| 国产在线男女| 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 亚洲av电影不卡..在线观看| 久久亚洲国产成人精品v| 亚洲精品aⅴ在线观看| av在线蜜桃| 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 美女大奶头视频| 免费看a级黄色片| 五月伊人婷婷丁香| 日本wwww免费看| 精品久久国产蜜桃| 久久久精品欧美日韩精品| 日本一本二区三区精品| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 亚洲精品,欧美精品| 26uuu在线亚洲综合色| 久久久久久伊人网av| 亚洲欧洲日产国产| 听说在线观看完整版免费高清| 嫩草影院新地址| 天天躁日日操中文字幕| 国产亚洲av嫩草精品影院| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲av不卡在线观看| 欧美一级a爱片免费观看看| 91狼人影院| 亚洲精品亚洲一区二区| 色哟哟·www| 性插视频无遮挡在线免费观看| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产在线一区二区三区精| 欧美高清成人免费视频www| 久久热精品热| 成人特级av手机在线观看| 简卡轻食公司| 99久久精品一区二区三区| 在线天堂最新版资源| 街头女战士在线观看网站| 国产高清国产精品国产三级 | 日韩av在线大香蕉| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产伦精品一区二区三区四那| 亚洲电影在线观看av| 五月伊人婷婷丁香| 99久久中文字幕三级久久日本| 久久人人爽人人爽人人片va| 免费观看性生交大片5| 亚洲人与动物交配视频| 成人美女网站在线观看视频| 久久鲁丝午夜福利片| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 熟女人妻精品中文字幕| 秋霞伦理黄片| 日韩av不卡免费在线播放| 亚洲国产欧美人成| 性插视频无遮挡在线免费观看| 一级黄片播放器| 精品久久久噜噜| 欧美激情久久久久久爽电影| 久久99蜜桃精品久久| 少妇的逼好多水| 国产成人a∨麻豆精品| 女人被狂操c到高潮| 国产高清三级在线| 波多野结衣巨乳人妻| 精品不卡国产一区二区三区| 欧美日韩在线观看h| 精品一区在线观看国产| 午夜福利视频1000在线观看| 韩国高清视频一区二区三区| 成人美女网站在线观看视频| h日本视频在线播放| 国内揄拍国产精品人妻在线| 在线观看美女被高潮喷水网站| 国产精品一区www在线观看| 午夜视频国产福利| 2022亚洲国产成人精品| 日韩av免费高清视频| 性插视频无遮挡在线免费观看| 久久99热6这里只有精品| 国产探花在线观看一区二区| 久久久久久九九精品二区国产| av一本久久久久| 亚洲成人久久爱视频| 欧美日本视频| 五月伊人婷婷丁香| 国产av国产精品国产| 青春草国产在线视频| 天堂网av新在线| av.在线天堂| 日韩制服骚丝袜av| 男女视频在线观看网站免费| av女优亚洲男人天堂| 国产激情偷乱视频一区二区| 蜜臀久久99精品久久宅男| 超碰av人人做人人爽久久| 成人亚洲精品av一区二区| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 国产黄色免费在线视频| 国产黄片视频在线免费观看| 内地一区二区视频在线| 精品熟女少妇av免费看| 亚洲欧洲日产国产| 欧美3d第一页| 白带黄色成豆腐渣| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 亚洲精品国产av蜜桃| h日本视频在线播放| 亚洲精品乱久久久久久| 简卡轻食公司| 欧美+日韩+精品| 日韩精品有码人妻一区| 久久久久九九精品影院| 久久久精品免费免费高清| 人人妻人人澡欧美一区二区| 久久6这里有精品| 国产在视频线在精品| av在线蜜桃| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产片特级美女逼逼视频| 最近最新中文字幕大全电影3| 亚洲经典国产精华液单| 看非洲黑人一级黄片| 国产精品熟女久久久久浪| 国产探花在线观看一区二区| 亚洲欧美精品专区久久| a级毛片免费高清观看在线播放| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 特级一级黄色大片| 99久久精品热视频| 国产在视频线精品| 老女人水多毛片| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 在线天堂最新版资源| 国产精品日韩av在线免费观看| 免费看av在线观看网站| 天天一区二区日本电影三级| 中文字幕av成人在线电影| 国产精品日韩av在线免费观看| 亚洲成人一二三区av| 成年版毛片免费区| 黄片wwwwww| 天美传媒精品一区二区| 久久久久久久国产电影| 99久久九九国产精品国产免费| 美女大奶头视频| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 高清在线视频一区二区三区| 日韩欧美 国产精品| 久久综合国产亚洲精品| 欧美成人午夜免费资源| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 亚洲av.av天堂| 一个人观看的视频www高清免费观看| 99久国产av精品| 成人亚洲欧美一区二区av| 最新中文字幕久久久久| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 亚洲av电影不卡..在线观看| 九草在线视频观看| 亚洲av免费在线观看| 久久久久性生活片| 免费av不卡在线播放| a级毛片免费高清观看在线播放| 国产片特级美女逼逼视频| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 免费观看在线日韩| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 身体一侧抽搐| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产淫片久久久久久久久| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 国产人妻一区二区三区在| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 久久久久久久大尺度免费视频| 国产成人精品久久久久久| 超碰av人人做人人爽久久| 久久精品国产亚洲av天美| 国产男女超爽视频在线观看| 我要看日韩黄色一级片| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产成人福利小说| 国产久久久一区二区三区| 日本-黄色视频高清免费观看| 五月玫瑰六月丁香| 国产黄色视频一区二区在线观看| h日本视频在线播放| 综合色av麻豆| 日韩欧美国产在线观看| 国产精品福利在线免费观看| 国产亚洲精品久久久com| 内射极品少妇av片p| 亚洲av福利一区| 久久久久久久大尺度免费视频| 久久久久久九九精品二区国产| 国产成人a∨麻豆精品| 国产午夜精品一二区理论片| 亚洲伊人久久精品综合| 韩国高清视频一区二区三区| 国产一级毛片七仙女欲春2| av在线播放精品| 99久久精品一区二区三区| 精品久久久久久电影网| 国产乱来视频区| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 国产综合精华液| 精品久久久噜噜| 男人舔女人下体高潮全视频| 在线免费观看不下载黄p国产| www.av在线官网国产| 久久久久久伊人网av| a级毛色黄片| 精品熟女少妇av免费看| 青青草视频在线视频观看| 免费黄网站久久成人精品| 1000部很黄的大片| 精品久久久久久久末码| 人妻一区二区av| 高清日韩中文字幕在线| 久久久久网色| 内地一区二区视频在线| av专区在线播放| 成人毛片a级毛片在线播放| 2018国产大陆天天弄谢| 一区二区三区四区激情视频| 国产在视频线精品| 成人鲁丝片一二三区免费| 国产成人一区二区在线| 日本午夜av视频| 嫩草影院精品99| 午夜福利视频1000在线观看| 国产色婷婷99| av网站免费在线观看视频 | 一级毛片电影观看| 国产精品久久视频播放| 午夜久久久久精精品| 日本-黄色视频高清免费观看| xxx大片免费视频| 成人av在线播放网站| av专区在线播放| freevideosex欧美| 日本爱情动作片www.在线观看| 中文字幕制服av| 一个人看的www免费观看视频| 国产精品久久久久久精品电影| 最近手机中文字幕大全| 成年女人在线观看亚洲视频 | 亚洲国产精品sss在线观看| 日日干狠狠操夜夜爽| 精品久久久久久成人av| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 69av精品久久久久久| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 国产一区二区三区av在线| 水蜜桃什么品种好| 寂寞人妻少妇视频99o| 在线观看免费高清a一片| 国产又色又爽无遮挡免| 国产亚洲91精品色在线| 国产在线一区二区三区精| 91av网一区二区| 国产中年淑女户外野战色| 日本熟妇午夜| 亚洲精品色激情综合| 高清毛片免费看| 国产 一区精品| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 欧美xxⅹ黑人| 一二三四中文在线观看免费高清| 国产一区有黄有色的免费视频 | 中文欧美无线码| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 一级二级三级毛片免费看| 国产淫语在线视频| 国产一区亚洲一区在线观看| videos熟女内射| 日韩伦理黄色片| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 成人午夜高清在线视频| 国产欧美日韩精品一区二区| 婷婷色综合大香蕉| 国产黄色视频一区二区在线观看| 国产精品一区二区性色av| 能在线免费看毛片的网站| 岛国毛片在线播放| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产伦一二天堂av在线观看| 最近视频中文字幕2019在线8| 久久久a久久爽久久v久久| 3wmmmm亚洲av在线观看| 国产v大片淫在线免费观看| 人人妻人人澡欧美一区二区| 一级黄片播放器| 国产乱人视频| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲精品国产av成人精品| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲,欧美,日韩| 激情 狠狠 欧美| 中文字幕av在线有码专区| 亚洲av成人av| 最近最新中文字幕大全电影3| 精品一区二区免费观看| 成年av动漫网址| 3wmmmm亚洲av在线观看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 亚洲欧美日韩无卡精品| 天堂俺去俺来也www色官网 | 国产精品熟女久久久久浪| 高清午夜精品一区二区三区| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 亚洲精品国产成人久久av| 国产激情偷乱视频一区二区| 日韩av免费高清视频| 青春草视频在线免费观看| 亚洲精品乱久久久久久| 男女那种视频在线观看| 最近最新中文字幕免费大全7| 极品少妇高潮喷水抽搐| 最近最新中文字幕免费大全7| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产成人免费观看mmmm| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 精品人妻熟女av久视频| 欧美日韩综合久久久久久| 亚洲高清免费不卡视频| 精品不卡国产一区二区三区| 能在线免费看毛片的网站| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国产淫片久久久久久久久| 别揉我奶头 嗯啊视频| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 天堂俺去俺来也www色官网 | 一级二级三级毛片免费看| 国产精品不卡视频一区二区| 99热网站在线观看| 九九爱精品视频在线观看| 成人国产麻豆网| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产精品一区二区性色av| 国产免费视频播放在线视频 | 97热精品久久久久久| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 内射极品少妇av片p| 国产黄色小视频在线观看| 日本熟妇午夜| 六月丁香七月| 国产精品.久久久| 美女内射精品一级片tv| 全区人妻精品视频| 亚洲精品日本国产第一区| 欧美精品一区二区大全| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国产视频内射| 亚洲精品日韩av片在线观看| 九九爱精品视频在线观看| 免费av毛片视频| 真实男女啪啪啪动态图| 国产精品一区二区三区四区久久| 欧美潮喷喷水| 最近视频中文字幕2019在线8| 麻豆成人av视频| 69人妻影院| 国产精品.久久久| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 大陆偷拍与自拍| 一本久久精品| 国产高潮美女av| 乱系列少妇在线播放| 日韩人妻高清精品专区| 2021少妇久久久久久久久久久| 国产精品一区二区在线观看99 | 人妻制服诱惑在线中文字幕| 91精品伊人久久大香线蕉| 欧美最新免费一区二区三区| 99久久精品国产国产毛片| 国产av码专区亚洲av| 免费观看无遮挡的男女| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 在线免费观看的www视频| 久久久久久久国产电影| 国产不卡一卡二| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 久久这里只有精品中国| 最近最新中文字幕大全电影3| 亚洲av福利一区| 午夜视频国产福利| 天美传媒精品一区二区| 亚洲成色77777| 高清欧美精品videossex| 人妻夜夜爽99麻豆av| 最近的中文字幕免费完整| 街头女战士在线观看网站| 99久国产av精品| 久久99热这里只有精品18| 99热这里只有是精品50| 国产av不卡久久| 在线观看人妻少妇| 久久久成人免费电影| 午夜福利成人在线免费观看| 高清日韩中文字幕在线| 国产欧美日韩精品一区二区| 一级毛片久久久久久久久女| 成人亚洲精品一区在线观看 | 高清在线视频一区二区三区| 色吧在线观看| 联通29元200g的流量卡| 国内精品一区二区在线观看| 欧美精品国产亚洲| 亚洲国产精品国产精品| 少妇丰满av| 亚洲精品456在线播放app| 亚洲自拍偷在线| 成年免费大片在线观看| 国产三级在线视频| 国产中年淑女户外野战色| av网站免费在线观看视频 | 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产黄a三级三级三级人| 午夜精品一区二区三区免费看| 日韩伦理黄色片| 中文字幕亚洲精品专区| av免费观看日本| 中文字幕亚洲精品专区| 五月伊人婷婷丁香| 欧美日韩亚洲高清精品| 日本色播在线视频| 免费看av在线观看网站| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 在线免费十八禁| 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲国产精品成人久久小说| 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 成年女人在线观看亚洲视频 | 久久久精品欧美日韩精品| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 国产av不卡久久| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产精品三级大全| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 一个人免费在线观看电影| 波野结衣二区三区在线| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 尾随美女入室| 一个人免费在线观看电影| 看免费成人av毛片| 欧美激情在线99| 日本黄大片高清| 99热这里只有是精品在线观看| 亚洲国产av新网站| 成人午夜精彩视频在线观看| 两个人视频免费观看高清| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 日日干狠狠操夜夜爽| 女人久久www免费人成看片| 国产精品久久视频播放| 日韩av不卡免费在线播放| 18禁动态无遮挡网站| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 国模一区二区三区四区视频| 日韩av不卡免费在线播放| 熟妇人妻不卡中文字幕| 国产av不卡久久| 国产一区二区三区综合在线观看 | av免费观看日本| 直男gayav资源| a级毛片免费高清观看在线播放| 看十八女毛片水多多多| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产av码专区亚洲av| 久久久久性生活片| 亚洲欧美日韩无卡精品| 久久久久久久国产电影| 黑人高潮一二区| 伦精品一区二区三区| 午夜福利视频1000在线观看| 中文欧美无线码| 18禁动态无遮挡网站| 美女国产视频在线观看| 91精品一卡2卡3卡4卡| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 美女内射精品一级片tv| 欧美三级亚洲精品| 国产中年淑女户外野战色| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产午夜精品一二区理论片| 国产精品久久视频播放| 午夜福利在线在线| 久久久久久久久久久丰满| 97在线视频观看| 国内精品一区二区在线观看| 一区二区三区免费毛片| av在线蜜桃| 成人亚洲精品av一区二区| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 国产男女超爽视频在线观看| 久久久久九九精品影院| 1000部很黄的大片| 99热6这里只有精品| 国产真实伦视频高清在线观看| 如何舔出高潮|