益氣復(fù)原合劑微生物限度檢查方法的驗證

孔燕興 黃校鋒 黃亞彬

（1 廣東省廣州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科，廣州510800；2 廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣州510800）

益氣復(fù)原合劑微生物限度檢查方法的驗證

孔燕興1黃校鋒2黃亞彬1

（1 廣東省廣州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科，廣州510800；2 廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣州510800）

目的 驗證益氣復(fù)原合劑的微生物限度檢查方法是否適用于該供試品的檢查。方法 細菌計數(shù)采用常規(guī)法，霉菌及酵母菌計數(shù)按常規(guī)檢查法，控制菌按常規(guī)檢查法。結(jié)果 稀釋劑對照組的菌回收率大于70%，試驗組的菌回收率大于70%；陰性對照組未檢出陰性對照菌，試驗組檢出陽性試驗菌。結(jié)論 可以用該微生物限度檢查法進行益氣復(fù)原合劑的檢查。

益氣復(fù)原合劑；微生物限度檢查法；驗證

益氣復(fù)原合劑是我院制劑室2012年獲得批準(zhǔn)文號的新制劑品種，具有益氣活血、通絡(luò)開竅的作用。用于中風(fēng)及中風(fēng)后遺癥之偏癱肢體乏力、失語、癡呆等。為了保證檢驗方法的科學(xué)性，現(xiàn)對我院制劑室生產(chǎn)的益氣復(fù)原合劑的微生物限度檢查方法進行方法學(xué)驗證，驗證此方法是否適用于該供試品的檢查。

1 材料與儀器

1.1 試驗樣品 藥品名稱：益氣復(fù)原合劑，批號：120120，來源：廣州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院制劑室。

1.2 驗證用儀器

1.2.1 一般儀品 霉菌培養(yǎng)箱（MJ-160-DSM）、隔水式電熱恒溫箱（PYX-DHS-35X-40）、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG- 9053A）、數(shù)顯立式壓力蒸汽滅菌器（YXQLS-50S）、電子天平等。

1.2.2 玻璃器皿 錐形瓶、培養(yǎng)皿、量筒、試管、吸管等。

1.3 驗證用菌種 金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]；大腸埃希菌[CMCC(B)44102]；枯草芽孢桿菌[CMCC(B) 63501]；白色念珠菌[CMCC(F)98001]；黑曲霉菌[CMCC (F)98003]，均由中國藥品生物制品鑒定所提供。

1.4 驗證用培養(yǎng)基及稀釋劑 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基；膽鹽乳糖培養(yǎng)基；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基；改良馬丁培養(yǎng)基；曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基，均由中國藥品生物制品鑒定所提供。

2 驗證條件

無菌室環(huán)境潔凈度為10000級，局部潔凈度為100級，凈化消毒30min以上，供試品及滅菌的器具等經(jīng)傳遞窗紫外殺菌燈照射30min置無菌室內(nèi)，試驗人員手消毒后穿無菌服進入操作間。

3 方法與結(jié)果

3.1 菌液制備[1]接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的新鮮斜面培養(yǎng)物接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于35℃培養(yǎng)18～24h，分別取各菌種培養(yǎng)液1ml加入0.9%無菌氯化鈉溶液9ml中，10倍依次稀釋[3]，金黃色葡萄球菌稀釋至10-5，大腸埃希菌稀釋至10-7，枯草芽孢桿菌稀釋至10-5，約為50～100cfu/ml，備用。

接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，于23～28℃培養(yǎng)23～48h，取培養(yǎng)液1ml加入0.9%無菌氯化鈉溶液9ml中，10倍依次稀釋至10-5，約為50～100cfu/ml，備用。

取黑曲霉的新鮮斜面培養(yǎng)物，用0.9%無菌氯化鈉溶液5ml將孢子洗下，吸取此溶液1ml置于一個無菌的比色管中，加0.9%無菌氯化鈉溶液適量與標(biāo)準(zhǔn)比濁管進行比濁，取比濁后的菌懸液1ml加入0.9%無菌氯化鈉溶液9ml中，10倍依次稀釋至10-4，約為50～100cfu/ ml，備用。

3.2 供試液制備 取供試品10ml，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨[2]緩沖液至100ml，混勻，為1:10供試液。

3.3 細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)驗證試驗

3.3.1 試驗組 取1∶10供試液1ml，分別加入5個平皿中（每皿0.2ml），加入各陽性細菌試驗菌1ml，立即傾注相應(yīng)的瓊脂培養(yǎng)基，置32℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，測定細菌數(shù)。霉菌及酵母菌計數(shù)采用常規(guī)法，取1∶10供試液1ml，加入各霉菌及酵母菌試驗菌1ml，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，置25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，測定霉菌及酵母菌數(shù)。

3.3.2 菌液組 取稀釋好的各菌液1ml，分別加入平皿中，加入相應(yīng)培養(yǎng)基，置規(guī)定條件培養(yǎng)，測定所加的試驗菌數(shù)。

3.3.3 供試品對照組 按試驗組方法，測定供試品本底菌數(shù)。

3.3.4 稀釋劑對照組 取稀釋劑替代供試液，方法同試驗組。

3.3.5 回收率三次測定結(jié)果 見表1。

試驗組菌回收率（%）={（試驗組平均菌落數(shù)-供試品對照組平均菌落數(shù)）/菌液組平均菌落數(shù)}×100% ；

稀釋劑對照組菌回收率（%）=（稀釋劑對照組平均菌落數(shù)/菌液組平均菌落數(shù)）×100%。

3.4 控制菌檢查方法的驗證

3.4.1 試驗組 取供試液10ml及10～100cfu試驗菌加入100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，在35～37℃培養(yǎng)24h，取培養(yǎng)物0.2ml接種至含5mlMUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)培養(yǎng)，于5h、24h在366nm紫外線下觀察，同時用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對照。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液。

3.4.2 陰性對照組 取金黃色葡萄球菌50～100cfu為對照，同法操作。

3.4.3 控制菌檢查方法驗證結(jié)果 見表2。

表1 常規(guī)法驗證各試驗菌的回收試驗結(jié)果 （cfu.ml-1）

表2 控制菌檢查方法驗證結(jié)果

3.5 結(jié)果分析

3.5.1 細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)驗證結(jié)論 在三次試驗中，稀釋劑對照組的菌回收率均大于70%，試驗組的菌回收率均大于70%，說明供試品無抑菌性；可采用常規(guī)法進行試驗。

3.5.2 控制菌驗證結(jié)論 在三次試驗中，陰性對照組未檢出陰性對照菌，試驗組檢出陽性試驗菌，可用常規(guī)法進行控制菌檢驗。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典第一部[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010,附錄79-88.

[2] 陳建梅.微生物限度檢查方法驗證影響因素分析[J].藥品藥檢,2008,5(12): 66-68.

[3] 鄭繼明.理氣解郁合劑微生物限度檢查驗證[J].St rait Pharmaceutical Journal,2010,22(10):75-77.

10.3969/j.issn.1672-2779.2012.18.109

1672-2779（2012）-18-0

2012-07-26）