氧化應激與總肺缺血再灌注細胞凋亡的相關性及川芎嗪干擾的影響

王曉楊 毛宇飛 王萬鐵 郝茂林 張 波

(金華職業(yè)技術學院醫(yī)學院病理生理教研室，浙江 金華 321000)

組織缺血再灌注(IR)時可觀察到細胞凋亡的發(fā)生〔1，2〕，并認為細胞凋亡可能是心臟IR損傷發(fā)生的重要機制之一〔3〕。川芎嗪(TMP)對大鼠IR視網(wǎng)膜氧化應激水平及細胞凋亡有重要的影響〔4〕。本課題探討肺IR損傷中氧化應激與細胞凋亡的關系，并探討川芎嗪對其的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 細胞凋亡試劑:原位末端標記試劑盒 (3%H2O2、Labelling緩沖液)、Tris鹽酸緩沖液(TBS)、封閉液生物素化抗地高辛抗體、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑等(武漢博士德公司提供)。川芎嗪注射液(批號03041711:山東長富潔凈藥業(yè)有限公司提供)。丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒由南京建成生物工程公司提供。

1.1.2 動物 由溫州醫(yī)學院實驗動物中心提供健康清潔級日本大耳白兔60只，體重2.5～3.0 kg，雌、雄不拘。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及方法 隨機分為三組，每組30只:(1)假手術組。(2)IR組，再分三個亞組，每個亞組10只，開胸后左肺門阻斷1 h，分別開放接受1、3、5 h的再灌注，于缺血前60 min靜脈滴注與川芎嗪等量的生理鹽水。(3)川芎嗪干預組(TMP組)，于缺血前60 min靜脈滴注川芎嗪60 mg/kg，其余操作同IR組。

1.2.2 模型制備 經(jīng)兔耳緣靜脈注射20%烏拉坦5 mg/kg，麻醉后仰臥位固定于手術臺。頸部正中切口，分離左頸外靜脈并插管，生理鹽水0.5～1.5 ml/min靜滴維持;左頸總動脈插管，接肝素化三通管;氣管切開插管，接動物呼吸機輔助呼吸，吸氧濃度100%，呼吸頻率30～40次/min，潮氣量雙側(cè)肺通氣15～20 ml/kg，單側(cè)8～10 ml/kg。沿胸骨左緣切斷第3、4、5肋骨開胸，離斷左側(cè)肺下韌帶，游離左肺門穿過阻斷帶備用，頸外靜脈注射肝素1 mg/kg抗凝。按Sekido等〔5〕報道的方法復制在體兔IR模型，即在呼氣末于左肺門處用阻斷帶結(jié)扎左側(cè)肺動脈、肺靜脈及左主支氣管，終止左肺血供為左肺缺血持續(xù)1 h;開放恢復供血和通氣為左肺再灌注。

1.2.3 血液指標測定 缺血1 h或術后1 h，再灌注1、3、5 h，從頸總動脈取血。3 500 r/min低溫離心15 min，取血清檢測下列指標:①血漿MDA含量:采用硫代巴比妥酸法，采用721分光光度計，在532 nm處比色測定。②血漿SOD活力:采用黃嘌呤氧化酶法，用721分光光度計在550 nm處比色測定。

1.2.4 標本的采集及處理 分別于再灌注1、3、5 h各時限點留取左肺標本，部分標本置于10%甲醛中固定，常規(guī)組織學處理、石蠟包埋切片;部分標本置液氮中，后放在-70℃冰箱中凍存待測。

1.2.5 觀察指標 肺細胞凋亡的檢測采用原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)介導的dUTP缺口末端標記法(TUNEL)，按TUNEL檢測試劑盒的使用說明書進行。

1.2.6 判定標準 在光學顯微鏡下觀察TUNEL陽性細胞，細胞核染色呈棕黃色為陽性細胞，即為發(fā)生凋亡的細胞。

1.2.7 肺組織細胞凋亡分析 于各組切片中任意抽取其中一張切片，采用目測半定量法分析結(jié)果，凋亡指數(shù)計算方法〔6〕:在高倍視野(×400)下，選擇5個視野，分別計數(shù)凋亡細胞和總細胞數(shù)。計算細胞凋亡陽性個數(shù)，用細胞凋亡指數(shù)(AI)表示。AI=(凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù))×100%

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行分析，所有實驗數(shù)據(jù)均以±s表示，兩組之間比較用t檢驗，單因素方差分析用于多組均數(shù)顯著性檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組總血漿SOD活力比較 IR組的SOD活力在再灌注1、3、5 h與假手術組比較顯著降低(均P＜0.05)，TMP組在缺血1 h再灌注1、3、5 h SOD活力與IR組比較明顯升高(均P＜0.01)，且TMP組在再灌注1、3、5 h與假手術組比較SOD活力明顯升高(均P＜0.01)。見表1。

2.2 各組兔血漿MDA含量比較 在缺血1 h再灌注1、3、5 h，IR組與假手術組比較MDA含量顯著增高(P＜0.01);TMP組在缺血后再灌注1、3、5 h的MDA含量顯著高于假手術組(P＜0.05，P＜0.01)，但卻顯著低于 IR 組(P＜0.05，P＜0.01)。見表2。

2.3 肺組織細胞AI IR組及TMP組缺血后再灌注1、3、5 h均可見肺組織細胞凋亡現(xiàn)象，但TMP組再灌注同時相點的肺組織細胞凋亡數(shù)顯著減少(P＜0.01);兩組中3 h組凋亡細胞數(shù)均明顯高于1 h與5 h組(P＜0.01)。采用Pearson法進行相關性分析發(fā)現(xiàn)，AI與 MDA含量呈正相關(r=0.764，P＜0.05)，與SOD活力呈負相關(r=-0.665，P＜0.05)。見表3，圖1。

表1 兔血漿SOD活力(NU/ml，±s，n=10)

表1 兔血漿SOD活力(NU/ml，±s，n=10)

與假手術組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與IR組比較:3)P＜0.01

組別1 h 3 h 5 h假手術組109.19±11.04 108.17±10.34 108.28±10.16 IR組 97.74.11±6.671) 99.30±11.281) 97.16±9.581)TMP組 112.15±7.92)3) 125.00±0.432)3) 120.13±7.992)3)

表2 兔血漿MDA含量(nmol/ml，±s，n=10)

表2 兔血漿MDA含量(nmol/ml，±s，n=10)

與假手術組比較:1)P＜0.01;與IR組比較:2)P＜0.05，3)P＜0.01

組別1 h 3 h 5 h假手術組1.61±0.34 1.76±0.38 1.72±0.23 IR組 4.20±0.641) 4.28±0.471) 4.28±0.831)TMP組 2.11±0.761)3) 2.24±0.721)2) 2.42±0.921)2)

表3 各組肺組織細胞AI指數(shù)比較(±s，n=10)

表3 各組肺組織細胞AI指數(shù)比較(±s，n=10)

與IR組比較:1)P＜0.01;與再灌注1 h和5 h組比較:2)P＜0.01

組別1 h 3 h 5 h假手術組0.60±0.74 0.61±0.64 0.62±0.72 IR組 14.9±1.911) 32.43 ±5.831)2) 18.72±2.251)TMP組 7.9±2.231)2) 22.40±3.021)2) 11.32±2.321)2)

圖1 各組光鏡下肺組織細胞凋亡情況(×400)

3 討論

細胞凋亡是在基因控制下的自主有序的細胞死亡，在維持細胞群體數(shù)量穩(wěn)定及功能方面具有重要的作用，組織器官大量的細胞凋亡能夠引起該器官的功能明顯降低。本研究表明肺IR過程可引起肺細胞凋亡率顯著升高，與Fischer等〔7，8〕等研究結(jié)果一致。肺IR細胞凋亡與氧化應激具有一定的相關性。本實驗表明川芎嗪具有拮抗肺IR過程中細胞凋亡的作用，并且川芎嗪具有減輕肺IR損傷產(chǎn)生的氧自由基介導的脂質(zhì)過氧化反應的作用。由自由基引發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應，導致生物膜上多聚不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應而引起生物膜結(jié)構(gòu)的破壞。MDA是脂質(zhì)過氧化反應的終產(chǎn)物，是反映脂質(zhì)過氧化反應的指標，同時也是自由基損傷的指標〔9〕。自由基還可以直接導致蛋白質(zhì)、核酸、多糖的結(jié)構(gòu)和功能受損〔10〕，這可能是肺IR過程中導致細胞凋亡的主要機制之一。SOD為內(nèi)源性的氧自由基清除機劑之一，催化超氧陰離子(O-2)轉(zhuǎn)化為H2O。氧化應激產(chǎn)物MDA與AI呈正相關，SOD可拮抗自由基的形成，抑制氧化應激反應，從而抑制減緩細胞凋亡的發(fā)生，故與AI呈負相關。該實驗表明川芎嗪可抑制氧化應激反應所致的自由基大量形成，從而減輕肺組織細胞凋亡，減輕由氧化應激導致細胞凋亡而引起的肺IR損傷。

1 Noda T，Iwakiri R，F(xiàn)ujimoto K，et al.Programmed cell death induced by ischemia-reperfusion in rat intestinal mucosa〔J〕.Am J Physiol，1998;274(2-1):270-6.

2 Bursch W，Paffe S，Putz B，et al.Determination of the length of the histological stages of apoptosis in normal liver and in altered hepatic foci of rats〔J〕.Carcinog enesis，1990;11(5):8472-53.

3 姚 震，焦解歌，馮建章，等 心肌缺血-再灌注損傷與細胞凋亡的關系實驗研究〔J〕.海南醫(yī)學院學報，2000;6(3):129-33.

4 施月歡，鄒秀蘭.川芎嗪對大鼠缺血再灌注視網(wǎng)膜SOD，MD和NO水平及細胞凋亡的影響〔J〕.中國實用眼科雜志，2002;20(1):25-7.

5 Sekido N，Mukaida N，Harada A，et al.Prevention of lung reperfusion injury in rabbits by a monoclonal antibody against in interleukin-8〔J〕.Nature，1993;365(6447):654-7.

6 段 紅，李 源，王鮮平，等.川芎嗪對缺血再灌注大鼠心肌細胞凋亡的影響〔J〕.武警醫(yī)學，2000;11(2):70-3.

7 Fischer S，Cassivi SD，Xavier AM，et al.Cell death in human lung transplantation:apoptosis induction in human lungs during ischemia and after transplantation〔J〕.Ann Surg，2000;231(3):424-31.

8 Stammberger U，Gaspert A，Hillinger S，et al.Apoptosis induced by ischemia and reperfusion in experimental lung transplantation〔J〕.Am Thorac Surg，2000;69(5):1532-6.

9 王萬鐵.川芎嗪對實驗性腸缺血再灌注損傷中氧自由基的抑制作用〔J〕.中華中西醫(yī)雜志，2001;31(3);197-9.

10 林建東，廖秀玉，劉 寧，等.山莨菪堿防治急性肺損傷及機理的探討〔J〕.中國醫(yī)師雜志，2000;2(11):653-5.