老年膀胱造瘺患者生物被膜菌與泌尿系感染的相關性

李乃靜 白 雪 潘作東 何 平 (中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院老年病科，遼寧 沈陽 110004)

隨著高分子材料在臨床的廣泛應用，其相關感染日益引起人們的廣泛關注。膀胱造瘺管是解決老年患者尿路梗阻及排尿困難的有效方法，但細菌易于黏附于導管的表面形成生物被膜，導致難治性泌尿系感染。為深入了解生物被膜菌與老年生物材料相關泌尿系感染的關系，我們進行了如下研究。

1 資料與方法

1.1 對象 本組均為老年男性;年齡72～102歲，平均86歲。恥骨上膀胱造瘺術置管的患者61例，膀胱造瘺導管的材料均為硅膠導管。留置導管時間平均20個月。換管時間4～7 w，集尿袋更換時間3～5 d。置管原因:前列腺良性增生29例，前列腺或泌尿系腫瘤20例，腦血管病變后遺癥12例。

1.2 實驗儀器 24孔板(天津有機玻璃制品廠)、掃描電鏡(S-800日本HITACHI公司)、超聲清洗器(GX-250，北京醫(yī)療設備二廠)、低溫超速離心機(上海安亭公司)、LKB2117等電聚焦系統(tǒng)(LKB公司)、超凈工作臺 (上海醫(yī)用設備一廠)、鑒定儀(Bio-Merieux公司、法國)、S800掃描電鏡 (Hitachi公司，日本)。

1.3 細菌鑒定 用75%的乙醇紗布擦拭尿管外壁，用無菌剪截取尖端5 cm標本，分為3份，分別用于細菌鑒定、掃描電鏡觀察、超廣譜β內(nèi)酰胺酶(ESBLs)的檢測。首先將導管超聲震蕩15 min，使尿管表面生物被膜完全脫落于培養(yǎng)液中，搖勻后吸取10 μl，用生理鹽水以10倍梯度連續(xù)稀釋數(shù)倍后，各取10 μl置于胰酶大豆肉湯中培養(yǎng)48 h，然后進行細菌鑒定。

1.4 掃描電鏡觀察 用無菌生理鹽水反復漂洗導管5次，洗去浮游菌及其他黏附物。用PBS緩沖液緩慢漂洗3次，用2.5%戊二醛PBS溶液中4℃固定2 h，以pH7.2的磷酸緩沖液沖洗3次，再以1%鋨酸固定2 h，4℃雙蒸水沖洗3次，每次10 min，系列酒精梯度脫水，醋酸異戊酯置換，干燥后噴金，掃描電鏡觀察生物被膜菌形態(tài)。

1.5 ESBLs的檢測 將脫落于培養(yǎng)液中的菌體離心30 min，棄去上清液，以0.05 mol/L、pH7.0磷酸鉀緩沖液洗滌兩次后，將收獲的菌體懸浮在同樣適量的緩沖液中，用凍融法〔1〕使細菌菌體破壞，然后以低溫超速20 000 r/min離心60 min，上清液即為粗酶提取液。ESBLs的檢測采用標準紙片擴散法〔2〕，測試頭孢他啶和頭孢他啶/克拉維酸、頭孢噻肟和頭孢噻肟/克拉維酸的抑菌環(huán)直徑，用CLSI M100-S19標準進行判斷，當2組藥物中有任何一組在加克拉維酸后，抑菌環(huán)直徑與不加克拉維酸抑菌環(huán)直徑相比，增大值大于或等于5 mm時，確認產(chǎn)ESBLs。

1.6 統(tǒng)計學方法 計數(shù)資料組間比較行χ2檢驗。

2 結果

2.1 掃描電鏡觀察結果 61例膀胱造瘺患者中，17例平均插管時間(7.4±0.9)d，未見到膜狀物;44例平均插管時間(24.4±1.6)d，掃描電鏡觀察到導管表面覆蓋大量的纖維膜狀物，膜狀物中可見網(wǎng)狀裂紋，在裂紋中附著大量細菌，細菌聚集生長(圖1)。

圖1 細菌生物被膜(×8 000)

2.2 微生物學結果 61例膀胱造瘺患者中細菌培養(yǎng)陽性57例，占87%;培養(yǎng)陰性4例。其培養(yǎng)的陽性頻次依次為大腸埃希菌21株(34.4%)、銅綠假單胞菌14株(23.0%)、糞腸球菌11株(18.0%)、陰溝腸桿菌10株(16.4%)、表皮葡萄球菌4株(6.6%)、肺炎克雷白桿菌及產(chǎn)吲哚黃桿菌各2株(3.3%)、真菌6株(9.8%)。

2.3 ESBLs的檢測結果 ESBLs陽性菌株共31株(50.8%)，分別為大腸桿菌9株，銅綠假單胞菌6株，陰溝腸桿菌4株，肺炎克雷白桿菌2株。生物被膜菌中產(chǎn)酶陽性菌株39株，占生物被膜菌的86.6%;非生物被膜菌中產(chǎn)酶陽性菌株8株，占非生物被膜菌的47.1%。兩組檢出率差異顯著(P＜0.05)。

3 討論

泌尿系感染是醫(yī)院感染中最常見的感染之一，而院內(nèi)泌尿系感染約50% ～80%系留置尿管或膀胱造瘺所引起〔3〕。特別是老年患者，免疫功能相對較弱，而且往往伴發(fā)嚴重的基礎疾病。泌尿系感染的發(fā)病率隨年齡的增長而增加，且細菌耐藥性嚴重〔4〕，對生命健康構成較大威脅。

留置膀胱造瘺管引起尿路感染的原因很多，首先可造成膀胱損傷，破壞膀胱自然防御的屏障，使細菌更易黏附，且擴大了膀胱與外界的開放程度，增加了感染的機會。膀胱造瘺管引起尿路感染的另一個重要原因在于留置的尿管本身，目前臨床使用的尿管多為橡膠或硅膠材料。有研究發(fā)現(xiàn)，尿管植入24～48 h后，尿管內(nèi)可出現(xiàn)纖維蛋白膜狀沉積，成為細菌遷徙黏附的支架，細菌黏附后在導管內(nèi)表面定植并形成菌落，分泌多糖蛋白復合物即生物被膜〔5〕。本研究表明，留置造瘺管的時間越長，形成生物被膜的概率越高。常見的細菌包括大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、糞腸球菌、陰溝腸桿菌、表皮葡萄球菌等。細菌間通過數(shù)量感知系統(tǒng)，感知到細菌數(shù)量的變化，并進行信息傳導，最終形成生物被膜〔6〕。

細菌形成生物被膜后，其耐藥性大大增強。首先，組成生物被膜的多糖蛋白復合物能阻礙抗生素或其他殺菌劑的滲透，吸附并滅活部分抗生素水解酶，使進入生物被膜內(nèi)部的抗生素有效劑量大大降低〔7〕;同時，生物被膜菌由于其特殊的結構特點和生理特性，使其生長緩慢、代謝減低、對外界刺激不敏感，對抗菌藥物的通透性減弱，尤其是被膜深層的細菌很難被抗菌藥物殺滅。低于致死劑量的抗菌藥物反而有利于細菌開啟抗菌藥物水解酶如β-內(nèi)酰胺酶的表達〔8〕。本研究表明生物被膜菌ESBLs的檢出率明顯高于非生物被膜菌。且有研究表明，生物被膜菌較普通浮游細菌產(chǎn)生的ESBLs更具多樣性和復雜性，即同一菌株可攜帶多種不同的質粒，同一患者可分離到多種不同基因型的ESBLs產(chǎn)生菌〔9〕。這使其耐藥性明顯增加。

本研究表明，生物被膜和ESBLs的產(chǎn)生是導致老年膀胱造瘺患者難治性尿路感染的一個主要原因。深入研究生物被膜的形成機制，開發(fā)新型生物材料導管，將有利于解決臨床上老年導管相關性難治性尿路感染困擾。

1 李乃靜，李 偉，李勝岐.老年機械通氣患者氣管內(nèi)導管生物被膜的觀察〔J〕.中華老年醫(yī)學雜志，2006;25(2):126-7.

2 李 靜.超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的特點及其檢測進展〔J〕.中國醫(yī)學檢驗雜志，2008;9(2):117-20.

3 Trautner BW，Hull RA，Darouiche RO.Prevention of catheter associated urinary tract infection〔J〕.Curr Opinion Infectious Dis，2005;18(1):37-41.

4 Curtin JJ，Donlan RM.Using bacteriophages to reduce formation of catheter-associated biofilms by Staphylococcus epidermidis〔J〕.Antimicrob A-gents Chemother，2006;50(4):1268-75.

5 Cotar Al，Chifiriuc MC，Dinu S，et al.Quantitative real-time PCR study of the influence of probiotic culture soluble fraction on the expression of Pseudomonas aeruginosa quorum sensing genes〔J〕.Roum Arch Microbiol Immunol，2010;69(4):213-23.

6 Tamashiro E，Antunes MB，Gopikrishna G，et al.Implications of bacterial biofilms in chronic rhinosinusitis〔J〕.Braz J Infect Dis，2009;13(3):232-5.

7 Kuchma SL，Otoole GA.Surface-induced and biofilm-induced changes in gene expression〔J〕.Curr Opin Biotechnol，2000;11(5):429-33.

8 Xu KD，McFeters GA，Stewart PS，et al.Biofilm resistance to antimicrobial agents〔J〕.Micobiology Mar，2000;146(Pt 3):547-9.

9 谷 秀，譚明旗，李勝岐.銅綠假單胞菌生物被膜中AmpC酶和超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的檢測〔J〕.中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2004;14(14):69-72.