杜氏鹽藻葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶在真核細(xì)胞中的表達(dá)*

崔柳青，張 璐，張 磊，薛樂勛#

1)河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院鄭州450001 2)鄭州大學(xué)生物工程系細(xì)胞生物學(xué)研究室鄭州450001

杜氏鹽藻葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶在真核細(xì)胞中的表達(dá)*

崔柳青1，2)，張 璐1)，張 磊2)，薛樂勛2)#

1)河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院鄭州450001 2)鄭州大學(xué)生物工程系細(xì)胞生物學(xué)研究室鄭州450001

#通訊作者，男，1944年2月生，教授，研究方向:腫瘤與生物工程，E-mail:xuelx@zzu.edu.cn

杜氏鹽藻;葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶;真核細(xì)胞;表達(dá)

目的:分別構(gòu)建杜氏鹽藻葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(DsGPI)綠色熒光蛋白表達(dá)載體和真核表達(dá)載體。方法:PCR擴(kuò)增得到上、下游分別添加EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)的DsGPI基因，雙酶切后與綠色熒光蛋白表達(dá)載體pEGFP-C1連接，得到重組載體pEGFP-C1-DsGPI，轉(zhuǎn)染狗腎細(xì)胞MDCK，觀察綠色熒光蛋白在細(xì)胞中的定位;同理將上、下游分別添加BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)的DsGPI基因與真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)連接，得到pcDNA3.1-DsGPI，轉(zhuǎn)染食管癌EC9706細(xì)胞，分別應(yīng)用RT-PCR法和Western blot法檢測(cè)DsGPI mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果:DsGPI在MDCK細(xì)胞中定位于細(xì)胞核，在EC9706細(xì)胞中被有效表達(dá)。結(jié)論:成功構(gòu)建了DsGPI的綠色熒光蛋白表達(dá)載體和真核表達(dá)載體。

葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(glucose-6-phosphate isomerase，GPI)是在糖代謝過程中起重要作用的一種酶，其催化葡萄糖-6-磷酸與果糖-6-磷酸之間的相互轉(zhuǎn)化，并普遍存在于原核和真核生物中。近年來(lái)的研究證實(shí)，GPI是一種非常保守的酶［1］，不僅參與機(jī)體內(nèi)的糖代謝，而且還具有一些其他作用［2］，如在動(dòng)物細(xì)胞中作為自分泌運(yùn)動(dòng)因子(AMF)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖浸潤(rùn)［3］。在藻類細(xì)胞中GPI可能參與了鞭毛相關(guān)功能的執(zhí)行［4］，而藻類鞭毛已被作為研究鞭毛/纖毛與疾病的一種模型［5］。目前對(duì)杜氏鹽藻GPI尚未有深入研究的報(bào)道，其作為鞭毛相關(guān)蛋白是否與其他鞭毛相關(guān)蛋白一樣在真核細(xì)胞中發(fā)揮作用，是否也能影響一些疾病尤其是腫瘤都很值得探討。該研究構(gòu)建了杜氏鹽藻GPI(DsGPI)的綠色熒光蛋白表達(dá)載體pEGFP-C1-DsGPI和真核細(xì)胞表達(dá)載體 pcDNA3.1-DsGPI，研究 DsGPI在狗腎細(xì)胞MDCK中的定位，并觀察其在食管癌EC9706細(xì)胞中的表達(dá)，為進(jìn)一步探討其在真核細(xì)胞中的生物學(xué)功能提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株與質(zhì)粒 MDCK細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué)保藏中心)，真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)購(gòu)自Invitrogen公司，EC9706細(xì)胞、真核綠色熒光表達(dá)載體pEGFP-C1、人GPI綠色熒光蛋白表達(dá)載體pEGFP-C1-GPI、人GPI真核表達(dá)載體pcDNA3.1-GPI和大腸桿菌DH5α均由該研究室保存。

1.1.2 工具酶及主要試劑 LA Taq DNA聚合酶，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ及反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自大連寶生物公司;無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司;T4 DNA連接酶購(gòu)自Promega公司;轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000、RNA提取試劑Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;RPMI 1640培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco公司;兔抗人GPI抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，兔抗DsGPI多抗由該研究室制備保存，二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 引物 根據(jù)DsGPI全序列，設(shè)計(jì)用于構(gòu)建綠色熒光表達(dá)載體的一對(duì)引物:F1(5’-CCGGAAT TCATGTTGTCCAACTTCAAGCAGG-3’)和 R1(5’-CGCGGATCCTCATGGCAGCGAATCCACAG-3’)，同理設(shè)計(jì)用于構(gòu)建真核表達(dá)載體的一對(duì)引物F2(5’-CGCGGATCCATGTTGTCCAACTTCAAGCAGG-3’)和R2(5’-CCGGAATTCTCATGGCAGCGAATCCACAG-3’)，在其上下游分別引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)。設(shè)計(jì)用于半定量RT-PCR的引物，見表1。引物由北京博尚生物技術(shù)有限公司合成。

表1 用于RT-PCR的引物序列

1.2 pEGFP-C1-DsGPI和 pcDNA3.1-DsGPI的構(gòu)建

1.2.1 杜氏鹽藻cDNA的合成 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的鹽藻細(xì)胞，用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。取5 μg RNA作模板，加入反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的隨機(jī)引物并使總反應(yīng)體積為20μL。70℃變性5min后迅速冰浴，依次加入4μL 反應(yīng)緩沖液，2μL dNTP混合物，1μL RNase inhibitor，37 ℃ 5min 后加入 1μL MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶，37℃ 60min，70℃10min，結(jié)束反應(yīng)。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 取上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，分別用引物F1和 R1、F2和R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系:cDNA 模板 1μL，10 × Buffer 2.5μL，dNTP 2μL，上、下游引物各 0.25μL，LA Taq DNA聚合酶 0.25μL，無(wú)菌水 18.75μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5min;94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸2min，30個(gè)循環(huán);72℃延伸5min;4℃終止反應(yīng)。

1.2.3 載體的構(gòu)建及鑒定 用EcoRⅠ、BamHⅠ分別雙酶切PCR產(chǎn)物、pcDNA3.1(+)和pEGFP-C1，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切結(jié)果后回收、純化目的片段，將基因片段分別與對(duì)應(yīng)的載體片段經(jīng)16℃過夜連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒并行雙酶切鑒定，得綠色熒光蛋白表達(dá)載體pEGFP-C1-DsGPI和真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.1-DsGPI。將初步鑒定正確的菌液送北京博尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序以確定讀碼框是否正確。

1.3 pEGFP-C1-DsGPI在MDCK細(xì)胞中的定位將EMEM培養(yǎng)基粉末溶于1 L三蒸水中，加入5 g NaHCO3，混合均勻調(diào)整酸堿度至 pH 7.2 ～ 7.4，0.22 μm濾膜過濾，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清及雙抗的EMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)MDCK細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)條件為體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37℃。培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)80%左右時(shí)，嚴(yán)格按脂質(zhì)體2000的說(shuō)明書無(wú)菌技術(shù)操作要求，轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-DsGPI。以轉(zhuǎn)染pEGFP-C1、pEGFP-C1-GPI的細(xì)胞為對(duì)照。轉(zhuǎn)染24 h后，熒光顯微鏡下通過藍(lán)光激發(fā)觀察EGFP在細(xì)胞中的分布。

1.4 pcDNA3.1-DsGPI在 EC9706 細(xì)胞中的表達(dá)①EC9706細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)80%左右時(shí)，分別轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1-DsGPI、pcDNA3.1-GPI和空載體 pcDNA3.1(+)，轉(zhuǎn)染方法同 1.3。轉(zhuǎn)染后 12、24、48 和72 h分別收集細(xì)胞并提取RNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)DsGPI mRNA。②根據(jù)RT-PCR結(jié)果，確定轉(zhuǎn)染最佳時(shí)間，收集細(xì)胞并提取總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)蛋白到硝酸纖維素膜上，用GPI抗體及DsGPI多克隆抗體進(jìn)行Western blot分析，暗室曝光顯色。

2 結(jié)果

2.1 DsGPI cDNA全長(zhǎng)的擴(kuò)增 用Trizol試劑提取杜氏鹽藻細(xì)胞總RNA，電泳顯示為18 S、28 S兩條帶，紫外分光光度計(jì)測(cè)定A(260 nm)/A(280 nm)≥1.8，說(shuō)明其純度和完整性符合 RT-PCR要求。RT-PCR擴(kuò)增出DsGPI cDNA全長(zhǎng)，電泳結(jié)果顯示片段長(zhǎng)度與NCBI登錄的杜氏鹽藻DsGPI cDNA長(zhǎng)度一致(圖1)。

圖1 DsGPI基因全長(zhǎng)的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

2.2 DsGPI表達(dá)載體的鑒定 重組表達(dá)載體pcDNA3.1-DsGPI和 pEGFP-C1-DsGPI分別經(jīng) EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切后，電泳出約2 kb的DNA條帶，說(shuō)明目的基因DsGPI已經(jīng)插入對(duì)應(yīng)載體中(圖2)。經(jīng)測(cè)序，插入片段長(zhǎng)度正確且讀碼框無(wú)誤。

2.3 DsGPI在MDCK細(xì)胞中的定位 轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-C1的MDCK細(xì)胞綠色熒光分布整個(gè)細(xì)胞，而轉(zhuǎn)染pEGFP-DsGPI和pEGFP-GPI的MDCK細(xì)胞綠色熒光均定位于細(xì)胞核區(qū)域。

2.4 pcDNA3.1-DsGPI在 EC9706 細(xì)胞中的表達(dá)轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1-DsGPI、pcDNA3.1-GPI的 EC9706細(xì)胞中GPI和DsGPI mRNA的表達(dá)水平均較未轉(zhuǎn)染和空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞升高，并且在24 h時(shí)升高最明顯(圖3)。收集轉(zhuǎn)染后24 h的細(xì)胞進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1-GPI和 pcDNA3.1-DsGPI的EC9706細(xì)胞中GPI和 DsGPI均能被有效表達(dá)，且表達(dá)水平高于未轉(zhuǎn)染和空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞(圖4)。

圖4 EC9706細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后目的蛋白的表達(dá)情況

3 討論

越來(lái)越多的證據(jù)表明，鞭毛/纖毛異常與腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［6］，并且以萊茵衣藻為模式生物已經(jīng)進(jìn)行了一系列鞭毛/纖毛與重要疾病因子的關(guān)系的研究［7］。DsGPI是鹽藻鞭毛相關(guān)蛋白，深入研究DsGPI對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響具有重要意義。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中GPI是個(gè)復(fù)雜的多功能蛋白，它不但參與糖酵解和糖異生等糖代謝過程，還具有以下功能，促進(jìn)人類髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞和B細(xì)胞的成熟，促進(jìn)胚胎脊柱生長(zhǎng)，參與精子凝集和神經(jīng)發(fā)育等，而最重要的是其能作為自分泌運(yùn)動(dòng)因子促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)［8］。因此，深入研究DsGPI的功能首先要使其在真核細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。

DsGPI的關(guān)鍵酶活位點(diǎn)以及預(yù)測(cè)的三維結(jié)構(gòu)都跟人GPI一致［9］，但研究DsGPI與人GPI生物學(xué)功能上的差異需要更多證據(jù)。該實(shí)驗(yàn)通過綠色熒光蛋白表達(dá)載體證實(shí)DsGPI在MDCK細(xì)胞中的定位和人的GPI定位非常相似:集中在細(xì)胞核區(qū)域，在胞質(zhì)其他部位也有分布。這是因?yàn)榕cGPI相互作用的底物大多分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體上［10］，而細(xì)胞核周圍的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體中分布有較多的GPI底物，大量的熒光融合蛋白與底物結(jié)合使得此區(qū)域綠色熒光富集。該研究初步證明了DsGPI能在MDCK細(xì)胞中的細(xì)胞核區(qū)域表達(dá)和定位，這為在其他細(xì)胞中研究DsGPI功能提供了可行性依據(jù)。該研究中作者構(gòu)建了DsGPI的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-DsGPI，并證實(shí)該載體可在食管癌EC9706細(xì)胞中有效表達(dá)，這為深入研究其在真核細(xì)胞中的功能奠定了基礎(chǔ)。

［1］ Grauvogel C，Brinkmann H，Petersen J.Evolution of the glucose-6-phosphate isomerase:the plasticity of primary metabolismin photosynthetic eukaryotes［J］.Mol Biol Evol，2007，24(8):1611

［2］ Munjral N，Gupta AK，Kaur N.Studies on glucose metabolizing enzymes in cytosolic and bacteroidal fractions of mungbean(Vigna radiata L.)and lentil(Lens culinaris L.)nodules ［J］.Indian J Biochem Biophys，2007，44(3):186

［3］ Chiu CG，St-Pierre P，Nabi IR，et al.Autocrine motility factor receptor:a clinical review［J］.Expert Rev Anticancer Ther，2008，8(2):207

［4］ Jia Y，Xue L，Li J，et al.Isolation and proteomic analysis of the halotolerant alga Dunaliella salina flagella using shotgun strategy［J］.Mol Biol Rep，2010，37(2):711

［5］ Pan J，Naumann-Busch B，Wang L，et al.Protein phosphorylation is a key event of flagellar disassembly revealed by analysis of flagellar phosphoproteins during flagellar shortening in Chlamydomonas［J］.J Proteome Res，2011，10(8):3830

［6］ Bettencourt-Dias M，Hildebrandt F，Pellman D，et al.Centrosomes and cilia in human disease［J］.Trends Genet，2011，27(8):307

［7］Ostrowski LE，Dutcher SK，Lo CW.Cilia and models for studying structure and function［J］.Proc Am Thorac Soc，2011，8(5):423

［8］Funasaka T，Hogan V，Raz A.Phosphoglucose isomerase/autocrine motility factor mediates epithelial and mesenchymal phenotype conversions in breast cancer［J］.Cancer Res，2009，69(13):5349

［9］ Cui L，Xue L，Li J，et al.Characterization of the glucose-6-phosphate isomerase(GPI)gene from the halotolerant alga Dunaliella salina［J］.Mol Biol Rep，2010，37(2):911

［10］Fairbank M，St-Pierre P，Nabi IR.The complex biology of autocrine motility factor/phosphoglucose isomerase(AMF/PGI)and its receptor，the gp78/AMFR E3 ubiquitin ligase［J］.Mol Biosyst，2009，5(8):793

(2012-03-28收稿 責(zé)任編輯王 曼)

Expression of Dunaliella salina glucose-6-phosphate isomerase in eukaryotic cells

CUI Liuqing1，2)，ZHANG Lu1)，ZHANG Lei2)，XUE Lexun2)
1)College of Bioengineering，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001 2)Laboratory for Cell Biology，Department of Bioengineering，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001

Dunaliella salina;glucose-6-phosphate isomerase;eukaryotic cell;expression

Aim:To construct Dunaliella salina glucose-6-phosphate isomerase(DsGPI)green fluorescent protein expression vector and eukaryotic expression vector.Methods:The complete cDNA sequences of DsGPI was cloned into the plasmid pEGFP-C1 to create a recombinant plasmid pEGFP-C1-DsGPI by using BamHⅠ and EcoRⅠ sites and identified.Localization of the EGFP fusion proteins was examined by fluorescence microscopy after the recombinant plasmids were transfected in MDCK cells.Recombinant plasmids pcDNA3.1(+)-DsGPI were constructed with the same method and transfected in EC9706 cells，DsGPI mRNA was detected by RT-PCR and DsGPI protein were examined by Western blot.Results:EGFP fusion proteins were mainly localized in the nucleus area in MDCK cells and expression of DsGPI increased in EC9706 cells.Conclusion:DsGPI green fluorescent protein expression vectors and eukaryotic expression vectors has been constructed successfully.

Q781

10.3969/j.issn.1671-6825.2012.04.003

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 31000580