椰子種皮油提取物對(duì)低密度脂蛋白氧化的抑制作用

趙曉莉，陳衛(wèi)軍，趙松林，張春梅，王 妨

1中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所產(chǎn)品加工研究室，文昌 571339;2海南大學(xué)食品學(xué)院，?？?570228

椰子種皮油提取物對(duì)低密度脂蛋白氧化的抑制作用

趙曉莉1，2，陳衛(wèi)軍1*，趙松林1，張春梅1，王 妨2

1中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所產(chǎn)品加工研究室，文昌 571339;2海南大學(xué)食品學(xué)院，?？?570228

本文研究了椰子種皮油提取物對(duì)低密度脂蛋白氧化的抑制作用，以水溶性VE(Trolox)作為對(duì)照，測(cè)定椰子種皮油提取物的總酚含量，總抗氧化能力，檢測(cè)提取物對(duì)低密度脂蛋白的氧化易感性，硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物(TBARS)值及銅絡(luò)合能力的影響。結(jié)果表明，椰子種皮油提取物的總酚含量為68.6 mg/g，總抗氧化能力也隨著濃度增大而加強(qiáng)，說(shuō)明該提取物具有較好的抗氧化活性。濃度為0.5 mg/mL的提取物能將低密度脂蛋白的延滯時(shí)間延長(zhǎng)了兩倍，丙二醛(MDA)含量也明顯下降，表明椰子種皮油提取物對(duì)低密度脂蛋白的氧化具有一定的抑制作用。

椰子種皮油提取物;低密度脂蛋白;TBARS;脂質(zhì)過(guò)氧化;銅絡(luò)合

低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)是人體血漿中攜帶大量膽固醇的主要蛋白質(zhì)，也含有大量亞油酸和花生四烯酸等不飽和脂肪酸，這些成分極易氧化變性而成為過(guò)氧化物，氧化LDL不再能結(jié)合到LDL受體上，而是與巨噬細(xì)胞的清除受體相結(jié)合，并形成泡沫細(xì)胞，是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的主要原因［1-3］。因此，如何抑制LDL的氧化，成了目前研究的熱門課題。

椰子種皮(coconut testa)是椰子硬殼內(nèi)椰肉上附著的一層薄皮，成熟時(shí)呈黑褐色，一般作為椰子加工過(guò)程中的副產(chǎn)物。種皮中也含有一定量的油脂，但椰子種皮油(coconut testa oil)一般作為工業(yè)用油，經(jīng)濟(jì)效益較低，但是據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，帶種皮的椰子油中富含多酚及其他活性物質(zhì)［4］。本文主要是體外利用Cu2+誘導(dǎo)LDL氧化，研究了椰子種皮油提取物(coconut testa oil extracts)對(duì)LDL氧化的抑制作用，為椰子種皮油的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

椰子種皮，自制，椰子采自于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地。

LDL、水溶性維生素E(6-Hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic Acid，Trolox)、福林酚試劑購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。

甲醇(西隴化工股份有限公司);異丙醇、氯化銅、磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉(廣州化學(xué)試劑廠);三氯乙酸(Trichloroacetic acid，TCA)(天津福辰化學(xué)試劑廠);2-硫代巴比妥酸(2-Thiobarbituric acid，TBA)和二乙烯三胺五乙酸(Diethylenetriaminepentaacetic acid，DTPA)(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。T-AOC總抗氧化能力試劑盒，購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

UVLINE9400紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，BECKMAN高速冷凍離心機(jī)，超聲波清洗儀，恒溫水浴鍋，R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備

1.2.1.1 椰子種皮油(CTO)的制備

新鮮椰子種皮，烘干，打碎，取種皮50 g，加入200 mL異丙醇，60℃，超聲波輔助提取3 h，真空抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，即得椰子種皮油。

1.2.1.2 椰子種皮油提取物(CTOE)的制備

［5］的方法，略加改進(jìn)。取椰子種皮油50 g，加入10 mL 80%甲醇(甲醇/水，v:v，8∶2)，超聲波輔助提取10 min，然后離心，2000×g，30 min，收集上層清液，重復(fù)提取三次，合并清液，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去甲醇，然后冷凍干燥。總酚含量采用福林-酚法測(cè)定，提取物的總酚含量為68.6 mg/g。

1.2.2 提取物抑制LDL氧化能力的測(cè)定

1.2.2.1 銅誘導(dǎo)LDL氧化(氧化動(dòng)力學(xué))

參考文獻(xiàn)［6］的方法，略加改進(jìn)。用10 mM pH 7.4的PBS(磷酸鹽緩沖液)將LDL濃度稀釋至100 μg/mL。取該濃度的LDL 100 μL，加入同體積濃度為0.5 mg/mL提取物/Trolox，混勻，于37℃水浴中水浴30 min，然后加入50 μL濃度為50 μM的CuCl2，用10 mM pH 7.4的PBS補(bǔ)充體積至1 mL，于234 nm處測(cè)試吸光值，每2 min讀數(shù)一次，共掃描8 h。濃度為1.0、1.5、2.0和2.5 mg/mL的提取物及Trolox，也分別按照上面的步驟，每個(gè)濃度3個(gè)平行，以不加提取物的組作為空白。

1.2.2.2 TBARS的測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定硫代巴比妥酸反應(yīng)物(TBARS)來(lái)評(píng)定LDL脂質(zhì)過(guò)氧化程度。參考文獻(xiàn)［7］，并加以改進(jìn)。取100 μg/mL的LDL100 μL，加入同體積的各濃度的提取物/Trolox，37℃水浴30 min后，加入50 mM的CuCl250 μL，再置于37℃水浴反應(yīng)10 h后，加入1 mL 20%的三氯乙酸(TCA)，1 mL 1%的硫代巴比妥酸(TBA)，沸水浴30 min，冷卻后于532 nm處測(cè)吸光值，以不加TBA作為空白。

1.2.3 提取物與銅絡(luò)合能力測(cè)定

1 mL各濃度的提取物，加入250 μL 5 mM的CuCl2，37℃水浴30 min，再加入1 mL 10 mM的DTPA，做全波長(zhǎng)掃描，從190 nm到850 nm，以不加DTPA作為空白［6］。

1.2.4 提取物總抗氧化能力的測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)采用鐵離子還原法(ferric reducing/antioxidant power assay，F(xiàn)RAP)測(cè)定總抗氧化能力，F(xiàn)e3+-吡啶三吖嗪(tripyridyl-triazine，TPTZ)可被樣品中的還原物質(zhì)還原為Fe2+，呈現(xiàn)出藍(lán)色，并于593 nm處有最大吸收，根據(jù)吸光度的大小計(jì)算樣品抗氧化活性的強(qiáng)弱。本次實(shí)驗(yàn)采用總抗氧化能力試劑盒，濃度梯度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL，取樣量為0.1 mL。

總抗氧化能力=［(ODU-ODC)/0.01］÷30×N

O DU——測(cè)定管吸光度值

O DC——對(duì)照管吸光度值

N——反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)(反應(yīng)液總體積/取樣量)

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有的數(shù)據(jù)均用Excel和SPSS11.5軟件處理，差異顯著性水平為P＜0.05，平均數(shù)之間的多重比較使用鄧肯新復(fù)極差檢驗(yàn)方法(DMRT)。

2 結(jié)果

2.1 椰子種皮油提取物對(duì)LDL氧化易感性的影響

圖1 椰子種皮油提取物對(duì)LDL氧化過(guò)程中共軛二烯形成的影響示意圖Fig.1 Influence of CTOE on copper-induced formation of conjugated dienes(CD)in LDL

對(duì)Cu2+誘導(dǎo)的LDL氧化過(guò)程進(jìn)行了8 h的掃描。LDL中的多不飽和脂肪酸容易被氧化，氧化后形成共軛二烯(conjugated dienes，CD)，CD在紫外區(qū)有吸收，在波長(zhǎng)234 nm處有最大吸收峰，脂質(zhì)過(guò)氧化程度越高，其吸光度數(shù)值越大，因此CD值可以作為判斷LDL氧化的指標(biāo)［8］。按CD產(chǎn)生的量隨時(shí)間變化來(lái)繪制LDL氧化曲線，如下圖，從樣品開(kāi)始被氧化到過(guò)氧化反應(yīng)加速這個(gè)階段被稱為延滯期，延滯階段與增殖階段的切線交點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的X軸的時(shí)間值就是延滯時(shí)間［9］，如圖1所示。通過(guò)對(duì)比模型的延滯時(shí)間來(lái)判斷樣品的抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力。

結(jié)果如表1所示，相同條件下，100 μL 0.5 mg/ mL的提取物加入后，延滯時(shí)間延長(zhǎng)至40 min，明顯延緩LDL氧化，而且隨著樣品濃度的增大，其延滯時(shí)間越來(lái)越長(zhǎng)，說(shuō)明其抑制LDL氧化的能力隨著濃度增大而加強(qiáng)，但效果略低于Trolox。

表1 椰子種皮油提取物對(duì)LDL氧化滯后時(shí)間的長(zhǎng)短的影響(n=3，±s)Table 1 The effect of CTOE on lag time in the oxidation process of LDL(n=3，±s)

表1 椰子種皮油提取物對(duì)LDL氧化滯后時(shí)間的長(zhǎng)短的影響(n=3，±s)Table 1 The effect of CTOE on lag time in the oxidation process of LDL(n=3，±s)

注:同一列中字母不同表示差異顯著(P＜0.05)Note:In the same column，the different letter means significant difference (P＜0.05)

組別Group濃度(mg/mL) Concentration延滯時(shí)間(min) Lag time空白組Blank group 0 19±2.08k0.5 40±2.52j樣品組Sample group 1.0 92±1.15h1.5 157±2.08f2.0 230±1.53d2.5 284±2.08b0.5 50±2.65i對(duì)照組Control group 1.0 136±1.53g1.5 189±2.08e2.0 217±2.08c2.5 276±2.08a

圖2 椰子種皮油提取物對(duì)LDL氧化過(guò)程中TBARS產(chǎn)物的抑制作用Fig.2 nhibitory effect of CTOE on production of TBARS in Cu2+-mediated oxidation of LDL

2.2 椰子種皮油提取物對(duì)LDL脂質(zhì)過(guò)氧化程度的影響

A532的值大小表明MDA的含量多少，從表2可以看出，在37℃下反應(yīng)10 h后，在氧化體系中加入樣品后，從0.5 mg/mL到2.5 mg/mL，其吸光值越來(lái)越小，表明生成的MDA越來(lái)越少，說(shuō)明椰子種皮油提取物對(duì)于LDL氧化的抑制呈劑量依賴性，與抑制LDL氧化動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)呈現(xiàn)的趨勢(shì)相同。

2.3 提取物銅絡(luò)合能力

提取物與銅離子絡(luò)合后，加入DTPA絡(luò)合剩余的銅離子，從圖3可以看出，Cu2+與DTPA的絡(luò)合物在287 nm附近有最大吸收，因?yàn)榉宇惢衔镌?80 nm之前有吸收但低于最大吸收峰，所以250 nm之前混合物的吸收?qǐng)D譜未呈現(xiàn)在圖3中。

圖3 提取物與Cu2+絡(luò)合能力Fig.3 The copper chelating capacities of CTOE

圖3呈現(xiàn)的是從250 nm到340 nm的吸光值，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［6］，Cu2+與DETAPAC(二乙烯三胺五乙酸酐)絡(luò)合物在650 nm附近有最大吸收峰，但本實(shí)驗(yàn)中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。吸收峰值越大，表明Cu2+與DTPA的絡(luò)合物越多，即提取物絡(luò)合能力越弱。結(jié)果如圖3所示，由上往下依次是Cu2+，0.5 mg/mL提取物，1.0 mg/mL提取物，1.5 mg/mL提取物，2.0 mg/ mL提取物，2.5 mg/mL提取物與DTPA絡(luò)合物掃描結(jié)果，可以看出峰值越來(lái)越小，說(shuō)明隨著濃度的增大，提取物與銅離子的絡(luò)合能力越強(qiáng)，表明抑制由Cu2+誘導(dǎo)的LDL氧化的能力越強(qiáng)。

2.4 提取物總抗氧化能力

FRAP法是一種簡(jiǎn)單易操作的測(cè)定總抗氧化能力的方法，用來(lái)測(cè)定在抗氧化劑存在下對(duì)Fe3+還原為Fe2+的影響［12，13］。從圖4可以看出，樣品濃度越大，抗氧化能力越強(qiáng)。

圖4 FRAP法測(cè)得椰子種皮油提取物總抗氧化能力Fig.4 The total antioxidant capacity of CTOE measured by FRAP assay

3 討論

諸多研究表明，LDL的氧化變性是動(dòng)脈粥樣硬化初期病變的重要因素?；钚匝鹾妥杂苫且环N因失去一個(gè)電子而形成的不對(duì)稱、不穩(wěn)定的原子和分子，具有很大的能量，以攻擊細(xì)胞組織中的脂質(zhì)，蛋白質(zhì)，糖類和DNA等物質(zhì)，企圖奪取一個(gè)電子以求得重新平衡，這就造成了脂質(zhì)和糖類的氧化、蛋白質(zhì)的變性、酶的失活、DNA結(jié)構(gòu)的切斷或堿基變化等種種改變，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜、遺傳因子等的損傷，因而引發(fā)種種疾病、癌變、老化等［14］。植物多酚能夠有效清除人體內(nèi)過(guò)剩的自由基，如能夠阻止活性氧引起的生物大分子(如脂類、蛋白質(zhì)等)的氧化損傷，且對(duì)由自由基誘發(fā)的生物大分子損傷起到保護(hù)作用［9］。

據(jù)文獻(xiàn)［4］報(bào)道，用帶有種皮的椰肉提取的椰子油中的多酚類物質(zhì)及其他活性物質(zhì)要比只用白椰肉提取的椰子油中含量高出許多，如沒(méi)食子酸，兒茶素，表兒茶素含量比較高等，說(shuō)明椰子種皮中也含有豐富的多酚類物質(zhì)。但是對(duì)于只用椰子種皮提取的油脂的研究，目前還沒(méi)未見(jiàn)有報(bào)道。本文研究結(jié)果表明椰子種皮油提取物具有較好的抗氧化活性和對(duì)Cu2+誘導(dǎo)的LDL氧化的抑制作用。保護(hù)作用的機(jī)制可能是提取物中含有的多酚類化合物清除氧自由基、阻斷過(guò)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、螯合游離的Cu2+［10］、生成絡(luò)合物、減少金屬離子催化的LDL的氧化等。但這些假設(shè)還需要鑒定提取物的成分以后才能確定。椰子種皮油提取物具有較強(qiáng)的抗氧化活性，可以提高椰子種皮油的利用價(jià)值，提高椰子加工副產(chǎn)物的利用率。

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Inhibition of Coconut Testa Oil Extracts on Human Low-density Lipoprotein Oxidation

ZHAO Xiao-li1，2，CHEN Wei-jun1*，ZHAO Song-lin1，ZHANG Chun-mei1，WANG Fang2

1Coconut Research Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Wenchang 571339，China;2College of Food，Hainan University，Haikou 570228，China

The inhibition activity of coconut testa oil extracts on human low density lipoprotein(LDL)was investigated by comparing with Trolox.Assays of copper-mediated LDL oxidation，thiobarbituric acid-reactive substances(TBARS) formation，total antioxidant capacity，total phenolic content and Cu2+binding studies were carried out in this paper.The results showed that the extracts of coconut testa oil had the evident inhibition effect on low density lipoprotein oxidation.The total phenolic content was 68.6 mg/100 g.And 100 μL extract at 0.5 mg/mL could increase the lag time to 41 min，but evidently decrease the value of TBARS.

coconut testa oil extracts;LDL;TBARS;lipid peroxidation;Cu2+binding

TS222+.1

A

1001-6880(2012)05-0668-04

2011-06-08 接受日期:2011-11-03

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(200903026-3);海南省社會(huì)發(fā)展科技專項(xiàng)(2010SF006)

*通訊作者 E-mail:xachenweijun@yahoo.com.cn