不同品種藥用菊花中游離糖類及游離氨基酸含量的HPLC分析

高學玲，賀曼曼，鄒敏亮，岳鵬翔，查芳芳

1安徽農(nóng)業(yè)大學;2安徽食品安全分析與檢測省級實驗室，合肥 230036;3黃山天健農(nóng)業(yè)科技有限公司，黃山 245700

不同品種藥用菊花中游離糖類及游離氨基酸含量的HPLC分析

高學玲1，2*，賀曼曼1，2，鄒敏亮3，岳鵬翔1，查芳芳1

1安徽農(nóng)業(yè)大學;2安徽食品安全分析與檢測省級實驗室，合肥 230036;3黃山天健農(nóng)業(yè)科技有限公司，黃山 245700

為比較不同品種菊花的品質(zhì)特征，本文采用HPLC法測定其游離糖類及游離氨基酸的含量。結(jié)果表明，不同品種菊花中游離糖類主要成分是果糖和葡萄糖，蔗糖和麥芽糖未檢出，總游離糖類含量約為9.07～18.76 g/100 g，其中黃山貢菊中含量最高，為18.76 g/100 g，黃菊中最低，為9.07 g/100 g;其總游離氨基酸含量約為0.563～2.806 g/100 g，七月菊中含量最高，為2.806 g/100 g，杭白菊中最低，為0.563 g/100 g。

菊花;游離糖類;游離氨基酸;含量測定

菊花(Flos chrysanthemi)為菊科植物菊(Chrysanthemum morifolium Ramat)的頭狀花序，為多年生草本植物，味甘苦，性微寒，具有疏風清熱，平肝明目，解毒消腫的功效，主治外感風熱或風溫初起，發(fā)熱頭痛，眩暈，目赤腫痛，疔瘡腫痛等［1］。杭白菊，貢菊，亳菊和滁菊載入2010年中國藥典第一部，可藥用。菊花同時被衛(wèi)生部列為既是食品又是藥品的物品名單，在中國為僅次于茶葉和咖啡的第三大飲品。目前報道的文獻關于菊花的研究主要集中在菊花中黃酮類化合物、綠原酸、揮發(fā)油等方面［2-5］，對于菊花中含量豐富的重要呈味成分及功能成分的游離糖類及游離氨基酸鮮有研究報道［6］。為了探討不同品種藥用菊花中游離糖類及游離氨基酸的分布狀況，本文采用HPLC法對11個不同品種菊花中2種游離單糖、2種二糖及22種游離氨基酸進行了含量測定及分析比較，以期為菊花的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

貢菊、金貢菊、金香菊、野菊花均為2009年11月雅氏貢菊廠收集;七月菊為2009年10月黃山區(qū)焦村鎮(zhèn)采摘;杭白菊、杭黃菊2009年12月購買于桐鄉(xiāng)市春發(fā)杭白菊制品廠;亳菊于2009年12月購買于安徽九九通醫(yī)藥有限公司;滁菊于2009年12月購買于安徽滁州菊泰工貿(mào);懷菊于2009年12月購買于河南焦作興旺懷藥貿(mào)易有限公司;祁菊于2009年12月購買于河北安國一方藥材有限公司。所有樣品均經(jīng)鑒定，并留存于安徽農(nóng)業(yè)大學茶與食品科技學院樣品室。

1.2 儀器

Aglient 1200SL高效液相色譜;AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器);RUC-5200型超聲波清洗機(上海睿祺);2-16P離心機(SIGMA)。

1.3 試劑

乙腈、甲醇、磷酸均為色譜純;十二水合磷酸氫二鈉、十水合四硼酸鈉、鹽酸均為分析純;水為超純水。

氨基酸衍生化試劑:硼酸鹽緩沖液、FMOC試劑、OPA試劑(4℃保存，使用前取約1mL于安培瓶中)。

1.4 實驗方法

1.4.1 游離單糖及寡糖的測定

1.4.1.1 標準品溶液制備

果糖(Sigma，純度99% ，產(chǎn)品號F0127)、葡萄糖(Sigma，純度99.5%，產(chǎn)品號G2870)、蔗糖(Sigma，純度99.5% 產(chǎn)品號84097)、麥芽糖(Sigma，純度99% ，產(chǎn)品號M9171)配成0.1、0.2、0.5、1.0和2.0 g/100 mL的混合標準溶液。

1.4.1.2 樣品制備

將菊花樣品粉碎后過24目，取5.000 g加入100.00 mL水室溫下超聲提取20 min，過濾后濾液以7800 rpm(離心力6461 g)離心12 min，然后用脫脂棉過濾得到提取液。用安捷倫C18-ODS-Box，500 mg小柱進行凈化，具體方法為:取2.00 mL ACN活化后棄去，再取2.00 mL水平衡后棄去，上2.00 mL樣液棄去，再上2.00 mL樣液收集，用0.22 μm濾頭過濾后即可進樣。

1.4.1.3 HPLC條件

系統(tǒng):安捷倫1200HPLC，示差折光率檢測器，色譜柱:ZORBAX Carbonhydrate Analysis Column (4.6×250 mm，5 μm)，流動相:75%ACN+25% H2O，流速:1.4 mL/min，25 min，柱溫:30℃，檢測器溫度:30℃，進樣量:20 μL。

1.4.2 游離氨基酸的測定

1.4.2.1 標準品溶液制備

氨基酸標準溶液100 pMoles/μL(安捷倫部件號:5061-3332)，250 pMoles/μL(安捷倫部件號: 5061-3333)，1 nMoles/μL(安捷倫部件號:5061-3334)、氨基酸輔助試劑盒(安捷倫部件號:5062-2478)、γ-氨基丁酸(GABA)標準品。以氨基酸輔助試劑盒中正纈氨酸和肌氨酸為內(nèi)標物，配成含內(nèi)標500 pMoles/μL，最終濃度分別為 90、225、900 pMoles/μL的氨基酸混合標準液。

1.4.2.2 樣品制備

將菊花樣品粉碎后過24目，取5.000 g加入100.00 mL水在室溫下超聲提取20 min，過濾后濾液以7800 rpm(離心力6461 g)離心12 min，然后用脫脂棉過濾得到提取液，再用0.22 μm濾膜過濾。準確吸取50 μL10 nMoles/μL內(nèi)標儲備液、950 μL樣品濾過液于2 mL樣品瓶中，充分搖勻后待測。

1.4.2.3 色譜條件

液相色譜柱:Aglient ZORBAX快速分離高通量Eclipse Plus C18(3.0×50 mm，1.8 μm)，流動相A: 10 mmol/L Na2HPO4，10 mmol/L Na2B4O7，pH 8.2，流動相B∶乙腈∶甲醇∶水=45∶45∶10(體積比)，流動相流速:0.85 mL/min，泵參數(shù):混合器和脈沖阻尼器用100 mm長的管線(0.12 mm內(nèi)徑)旁路連接，左柱溫箱:40℃，右柱溫箱:30℃，F(xiàn)LD檢測器設置:峰寬＞0.01 min(0.2 s)，7.00 min停止采集。流動相梯度條件見表1。.

表1 流動相梯度條件Table 1 Gradient system of mobile phase

待流速和柱溫穩(wěn)定后，進行空白運行。準確吸取三組氨基酸混合標準系列工作液注射入HPLC，在相同的色譜條件下注射測試液。測試液以峰面積定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 游離糖含量測定結(jié)果

各菊花樣品中游離糖類含量結(jié)果見表2，色譜圖見圖1。

菊花中游離糖主要為果糖和葡萄糖，其中果糖的含量為5.36～11.58 g/100 g，比葡萄糖高出1%～3%左右，蔗糖和麥芽糖并未檢出。菊花中總游離糖含量為9.07～18.76 g/100 g，黃山貢菊中含量最高，為18.76 g/100 g，約是滁菊、黃菊、杭白菊的2倍;黃山貢菊的變種金貢菊中游離糖含量也較高，為18.51 g/100 g;金香菊即黃山地區(qū)所產(chǎn)藥用菊花，其游離糖的含量也達到15.39 g/100 g;野菊花和河南的懷菊中游離糖含量相似，為13.91、13.46 g/100 g，七月菊、河北的祁菊及亳州的亳菊中游離糖含量相對較低，分別為11.62、11.28、10.09 g/100 g。

2.2 游離氨基酸含量測定結(jié)果

表2 不同品種菊花中游離糖類含量(g/100 g)Table 2 Contents of free sugars in different kinds of medicinal Flos chrysanthemi(g/100 g)

圖1 游離糖HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of free sugars

表3 不同品種菊花中游離氨基酸的含量(g/100 g)Table 3 Contents of free amino acids in different kinds of medicinal Floschrysanthemi(g/100 g)

各菊花樣品中游離氨基酸含量結(jié)果見表3，色譜圖見圖2。

氨基酸尤其是游離氨基酸不僅是菊花的重要呈味物質(zhì)之一同時也是菊花的主要營養(yǎng)成分。由結(jié)果可以看出，各不同品種菊花中均含有19種氨基酸，其中包括7種必需氨基酸、9種藥用氨基酸、5種增香氨基酸，分別占游離氨基酸總量的 8.14% ～22.12%、19.38%～39.33%、7.94%～20.15%?？傆坞x氨基酸含量七月菊中最高，達2.806 g/100 g，是杭白菊的4.98倍;滁菊、祁菊、貢菊、金貢菊、野菊、懷菊中含量相當，分別為2.066、1.962、1.926、1.852、1.663、1.628 g/100 g;黃菊、金香菊、亳菊中含量分別為1.203、1.173、0.931 g/100 g。各種游離氨基酸中天門冬酰胺，谷氨酰胺，精氨酸以及脯氨酸在菊花中的含量比較高;脯氨酸和精氨酸是與菊花甘味有關的氨基酸，其含量分別為 0.1511～0.6089、0.028～0.27 5 g/100 g，天門冬酰胺和谷氨酰胺的含量分別為 0.0525～0.9114、0.0215～0.5371 g/100 g。

注:a-必需氨基酸;b-藥用氨基酸;c-增香氨基酸;“-”未檢出Note:a-Essential amino-acid;b-Amino acids for medical purposes;c-Amino acids for increasing fragrances;“-”Not be detected

圖2 游離氨基酸HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatograms of free amino acids

3 結(jié)論與討論

3.1 目前關于菊花中游離糖的研究未見報道，本論文采用HPLC示差折光法檢測不同品種菊花中游離糖的含量，其中黃山貢菊中含量最高，其余依次為金貢菊、金香菊、野菊、懷菊、七月菊、祁菊、亳菊、杭白菊、黃菊、滁菊。關于菊花中氨基酸類研究報道主要有王慶蘭等采用日立835-50型氨基酸自動分析儀測定了不同品種菊花中的水解氨基酸含量［7］;盧金清等也采用日立835-50型氨基酸自動分析儀測定了金菊花中的游離氨基酸含量［8］。本論文采用了靈敏度更高的HPLC柱前衍生法測定了11個不同品種菊花中的氨基酸含量，其含量依次為七月菊＞滁菊＞祁菊＞貢菊＞金貢菊＞野菊＞黃菊＞金香菊＞亳菊＞杭白菊。

3.2 由于品種、產(chǎn)地、氣候土壤條件及加工方式不同，造成不同品種的藥用菊花中游離糖類和游離氨基酸類含量差異較大，黃山地區(qū)所產(chǎn)的黃山貢菊在游離糖類和游離氨基酸含量相對較高，這與黃山貢菊所特有的甘甜鮮醇滋味相一致，感官審評顯示黃山貢菊在風味上優(yōu)于其他品種菊花，黃山貢菊比較適合應用于菊花飲料和其它食品的開發(fā)，作為黃山市地道藥材具有較廣闊的開發(fā)和應用價值。

1 Nanjing University of Traditional Chinese Medicine(南京中醫(yī)藥大學)，Dictionary of Chinese Traditional Drugs.Shanghai Scientific and Technical Publishers(上?？茖W技術出版社)，2006:2898-2901.

2 Duan CX(段崇霞)，Zhang ZZ(張正竹).Comparison of the functional constituents in four kinds of medicinal Flos chrysanthemi.J Anhui Agric Univ(安徽農(nóng)業(yè)大學學報)，2008，35:99-105.

3 Jia LY(賈凌云)，Sun QS(孫啟時)，Huang SW(黃順旺).Comparison of various constituents in eight ofChrysanthemum.Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，2004，35:1180-1181.

4 Eun-Kyung Jung，Chemical composition and antimicrobial activity of the essential oil ofChrysanthemum indiumagainst oral bacteria.J Bacteriol Viro，2009，39(2):61-69.

5 Zhang J，Ding AW.Two new flavonoid glycosides fromChrysanthemum morifolium.Chin Chem Lett，2006，17:1051-1053.

6 Peng SP(彭少平)，Gu ZL(顧振綸).Comparison of trace elements and amino acids between Jinju and several kinds of commercial Flos chrysanthemi.Fujian J Tradit Chin Med(福建中醫(yī)藥)，2005，36(4):41-43

7 Wang QL(王慶蘭)，Lin HB(林慧彬)，Zhang SQ(張素芹).Comparison of amino acids in different kinds of Flos chrysanthemi.Chin J Tradit Med Sci Technol(中國中醫(yī)藥科技)，2005，12:249.

8 Lu JQ(盧金清)，Huang F(黃芳)，Jiang SJ(蔣勝軍)，et al.The determination of trace element and amino acids inDendranthema morifolium.J Hubei Coll Tradit Chin Med(湖北中醫(yī)學院學報)，2006，8:39-40.

Analysis of Free Sugars and Amino Acids in Different Kinds of Medicinal Flos Chrysanthemi

GAO Xue-ling1，2*，HE Man-man1，2，ZOU Min-liang3，YUE Peng-xiang1，ZHA Fang-fang1

1Anhui Agricultural University;2Anhui Provincial Lab of Food Safety Analysis and Detection，Hefei 230036，China;3Huangshan Tianjian Agricultural Sci-Tech Ltd，Huangshan 245700，China

The experiments were conducted with HPLC methods to determine the contents of free sugars and amino acids in various species of medicinal Flos chrysanthemi.The results showed that the main free sugars in Flos chrysanthemi were fructose and glucose;there were no sucrose and maltose.The total contents of free sugars in Flos chrysanthemi were in the range of 9.07～18.76 g/100 g.The highest content of total free sugars was found in Gongju with 18.76 g/100 g，while the lowest content in Huangju with 9.01 g/100 g.The total levels of free amino acids in Flos chrysanthemi ranged from 2.806 to 0.563 g/100 g，among which Qi yueju showed the highest level of total free amino acids with 2.806 g/100 g，Hang baiju showed the lowest level of total free amino acids with 0.563 g/100 g.

Flos chrysanthemi;free sugars;free amino acids;content determination

R284.2

A

1001-6880(2012)05-0639-05

2010-11-15 接受日期:2011-04-18

國家級星火計劃項目(2010GA710027)

*通訊作者 E-mail:sharling@ahau.edu.cn