消癌平注射液高效液相色譜指紋圖譜的建立

付曉秀，周國威，齊永秀

(1.山東省聊城市第二人民醫(yī)院，山東 聊城 252600;2.泰山醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271000)

1 儀器與試藥

Waters 600型高效液相色譜儀(美國Waters公司);Empower色譜工作站(美國Waters公司);KQ－500E型醫(yī)用超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。綠原酸對照品(批號為110753－200413，中國藥品生物制品檢定所);消癌平注射液(通化神源藥業(yè)有限公司);甲醇為色譜純(TEDIA);磷酸(H3PO4)、磷酸二氫鉀為分析純;蒸餾水(試驗室自制雙蒸水)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱:Diamonsil? C18柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm);流動相:A(甲醇)∶B(磷酸－磷酸二氫鉀)，梯度洗脫(表 1);流速:1.0 mL/min;檢測波長:327 nm，柱溫:室溫;進樣量:20 μL。在上述色譜條件下，消癌平注射液的9個色譜峰均得到良好分離。高效液相色譜圖見圖1。

2.2 溶液制備

精密稱取綠原酸對照品適量，加甲醇溶解并定容，得綠原酸對照品溶液(200 μg/mL);精密移取消癌平注射液1 mL于10 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

精密度試驗:精密吸取同一批供試品溶液20 μL，按擬訂色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。以綠原酸色譜峰(3號峰)為參照，計算10批供試溶液各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果的 RSD均小于3%，精密度良好，符合指紋圖譜的檢測要求。

表1 梯度洗脫程序

圖1 高效液相色譜圖

重復(fù)性試驗:取同一批消癌平注射液，按2.1項下方法制備供試品溶液6份，并各吸取20 μL，按擬訂色譜條件分別測定，記錄色譜圖。以綠原酸色譜峰(3號峰)為參照，計算10批供品試溶液各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果的 RSD與相對峰面積 RSD均小于3%，說明方法重復(fù)性良好，符合指紋圖譜的檢測要求。

穩(wěn)定性試驗:精密吸取同一批消癌平供試品溶液20 μL，按擬訂色譜條件測定，分別記錄 0，1，3，7，12，24 h 時的色譜圖。以綠原酸色譜峰(3號峰)為參照，計算10批消癌平供試品溶液各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果的 RSD均小于3%，消癌平供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4 高效液相指紋圖譜的構(gòu)建

共有指紋峰的標定:取10批消癌平注射液，分別按2.1項下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進行指紋圖譜測定，同時在該色譜條件下對綠原酸對照品溶液進樣分析。結(jié)果見圖2，其中3號色譜峰鑒定為綠原酸。

圖2 綠原酸和10批消癌平注射液的指紋圖譜

指紋圖譜相似度評價:將試驗數(shù)據(jù)導(dǎo)入國家藥典委員會編寫的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版”。參數(shù)設(shè)置為1)指紋圖譜積分參數(shù)，峰寬0.5，最小峰面積0.3，最小峰高1;2)參照譜圖，采用其中一批樣品指紋圖譜為參照譜圖;3)時間窗寬度，0.30;4)數(shù)據(jù)剪切，0～5 min內(nèi)為非保留組分色譜峰和溶劑峰，為避免對相似度值的影響，供試品指紋圖譜中0～5 min內(nèi)的色譜峰予以剪切，得到消癌平特征圖譜的共有模式圖(圖3)。計算10批消癌平注射液特征圖譜的相似度(見表2)。從表中數(shù)據(jù)可以看出，各批樣品的相似度均大于0.9，相似度良好。

圖3 消癌平注射液指紋圖譜的共有模式圖

表2 10批消癌平注射液特征圖譜的相似度

共有峰相對保留時間、相對峰面積:3號峰為綠原酸峰，峰面積穩(wěn)定，分離度良好，將其作為參照峰。以綠原酸峰(3號峰)的保留時間和色譜峰面積為1，計算各特征峰的相對保留時間(表3)和相對峰面積(表4)。10批消癌平注射液中各共有峰的相對保留時間和相對峰面積均小于2%，符合《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求》中的有關(guān)規(guī)定。

表3 10批消癌平注射液高效液相指紋圖譜相對保留時間

表4 10批消癌平注射液高效液相指紋圖譜相對峰面積

3 討論

對甲醇－水，乙腈－水，甲醇－磷酸二氫鉀緩沖液(磷酸調(diào)pH至3.0)，乙腈－0.1% 磷酸等不同組成、不同比例的流動相體系進行試驗。結(jié)果峰形良好，保留時間穩(wěn)定且分離度較好，故選用該系統(tǒng)為流動相。

本試驗采用高效液相色譜法建立了消癌平注射液的指紋圖譜，克服了只由單一化學(xué)成分作為質(zhì)量控制指標的難題，為消癌平注射液的總體研究提供了更加系統(tǒng)和微觀的信息。通過相似度計算可知，10批樣品的相似度均在0.9以上，結(jié)果表明各樣品指紋圖譜雖存在一定差異，但均具有相同的色譜特征峰，且各色譜峰的保留時間匹配較好，說明所建立的指紋圖譜具有較好的穩(wěn)定性和可控性，為消癌平注射液的抗癌性成分在質(zhì)量控制方面的研究提供了相關(guān)的理論參考依據(jù)，不足之處是尚需對高效液相色譜指紋圖譜中特征指紋峰進一步指認。

[1]劉順開.河南省新鄉(xiāng)市前衛(wèi)制藥廠.消癌平有效成分的提取及劑型制備[P]:中國，92102027:1993－10－06.