HPLC法同時測定高冠平膠囊中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1的含量

蘇英英 宋 敏 楊東花 劉 峰

(1山海丹醫(yī)院，陜西省西安市西八路116號，710004;2西安阿房宮藥業(yè)有限公司;3陜西步長制藥有限公司)

高冠平膠囊是由白芍、紅參、丹參、三七、靈芝、蒲黃等19味藥材提取加工制成的醫(yī)院制劑，具有益氣養(yǎng)血，活血化瘀、通絡(luò)潛陽的功效，主要用于治療冠心病、高血壓病及高血壓性心臟病［1～3］。紅參和三七既是方中的主藥，又為貴重藥材，有效成分均為皂苷類成分，我們按《中華人民共和國藥典》2010年版規(guī)定的紅參、三七藥材的含量測定指標(biāo)，建立了高效液相色譜法同時測定高冠平膠囊中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1含量的方法，用于控制本制劑的質(zhì)量，確保臨床療效。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Ultimate3000高效液相色譜儀(戴安公司);AR1140電子天平(梅特勒－托利多);ΜPT－1－10高純水機(jī)(北京子涵);KQ·250TB超聲波清洗器(昆山超聲)。

表1 梯度洗脫曲線

1.2 試藥 三七皂苷R1對照品(批號110745－200318，供含量測定用)、人參皂苷Rg1(批號110703－200415，供含量測定用)、人參皂苷 Re(批號0754－200013，供含量測定用)和人參皂苷Rb1對照品(批號110704－200420，供含量測定用)，購于中國食品藥品檢定研究院。高冠平膠囊(批號20091201、20100108、20100201，山海丹醫(yī)院提供)。水為超純水，乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 色譜柱:HibarC18(250mm ×4.6mm，5μm);流動相:以乙腈為流動相 A，水為流動相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫;流速:1.0mL/min;檢測波長:203nm;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:20μL;理論板數(shù)按三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1峰計算均不低于6000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含三七皂苷R10.1mg、人參皂苷Rg10.5mg、人參皂苷Re 0.3mg、人參皂苷Rb10.5mg的混合溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物，研細(xì)，取約8g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，稱定重量，超聲處理(功率250Hz，頻率40kHz)40min，提取液放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過，濾液蒸干，殘渣加水50mL溶解，用三氯甲烷50mL提取，棄去三氯甲烷層，水液用水飽和正丁醇振搖提取3次，每次50mL，合并正丁醇液，用氨試液150mL洗滌，棄去氨試液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 陰性對照品溶液的制備 按處方比例準(zhǔn)確稱取處方中除紅參和三七以外的其他各味藥材，模擬本品的制備工藝和供試品溶液的制備方法，制成陰性對照品溶液。

2.3 干擾試驗 按2.1項下色譜條件分別吸取對照品、供試品、陰性對照品溶液各20μL進(jìn)行測定，繪制色譜圖(見圖1)。結(jié)果在相同保留時間對照品與供試品溶液均出現(xiàn)色譜峰，而陰性對照品溶液在相應(yīng)位置無色譜峰，表明其他化學(xué)成分對含量測定結(jié)果無干擾，方法具有專屬性。

圖1 高冠平膠囊HPLC色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1對照品的混合溶液 2、4、8、16、24、32μL 注入液相色譜儀，測定其峰面積。分別以三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2。表明線性關(guān)系良好。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.5 精密度試驗 取分別含三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1對照品0.1026mg/mL、0.5221mg/mL、0.3055mg/mL、0.5018mg/mL 的混合對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，測定其峰面積，RSD分別為 0.641%、0.486%、0.796%、0.957%(n=5)，表明本方法精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性實驗 取同一供試品溶液，分別在0，2，4，6，8，10，12 和24h 按 2.1 項下色譜條件測定其峰面積。結(jié)果RSD為0.116%、0.853%、0.674%、1.055%(n=8)，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性實驗 取同一批樣品(批號20091201)，按2.2.2項下供試品溶液制備方法平行制備6份，按2.1項下色譜條件測定，含量分別為三七皂苷 R10.026mg/g、人參皂苷 Rg10.368mg/g、人參皂苷 Re 0.124mg/g、人參皂苷 Rb10.220mg/g，RSD 分別為0.544%、0.792%、0.359%、0.959%(n=6)，表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率實驗 精密稱取已知含量的樣品(批號20091201)4g，分別加入一定量的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1對照品，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣分析，計算回收率，結(jié)果見表3、表4、表5、表6。

表3 三七皂苷R1回收率試驗(n=6)

表4 人參皂苷Rg1回收率試驗(n=6)

表5 人參皂苷Re回收率試驗(n=6)

表6 人參皂苷Rb1回收率試驗(n=6)

2.9 樣品含量測定 取3批樣品按2.2.2項下供試品溶液制備方法，制成供試品溶液，按2.1項下色譜條件測定，測得樣品中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1的含量，結(jié)果見表7。

表7 樣品中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1的含量測定結(jié)果(mg/g，n=3)

3 討論

高冠平膠囊處方組成中紅參和三七是主藥，本文參照《中華人民共和國藥典》［4］2010年版一部中紅參和三七【含量測定】項下的色譜條件，并根據(jù)文獻(xiàn)［4～8］報道，對流動相梯度洗脫方法和供試品溶液的制備方法進(jìn)行了優(yōu)選研究，實現(xiàn)了采用高效液相色譜法同時測定高冠平膠囊中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1的含量，方法簡便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于高冠平膠囊的質(zhì)量控制。但本文僅對紅參和三七《中華人民共和國藥典》2010年版一部中規(guī)定的四個指標(biāo)成分三七皂苷R1及共有成分人參皂苷Rg1、Re、Rb1建立了含量測定方法，其他獨(dú)有的皂苷類成分，如三七含有的三七皂苷 R2、R4、R6、Fa，紅參中的人參皂苷Rb2、Rf等的含量控制方法有待進(jìn)一步研究。

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