軟脂酸制備3T3－L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型的方法1）

陳思思，王 彥，楊 靜，陳顯久

胰島素抵抗（IR）是胰島素作用的靶器官對胰島素作用的敏感性下降，即正常劑量的胰島素產(chǎn)生低于正常生物學(xué)效應(yīng)的一種代謝狀態(tài)。胰島素與細(xì)胞表面受體的結(jié)合或胰島素信號在胞內(nèi)的傳遞過程中，任何一個(gè)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)環(huán)節(jié)受到抑制均有可能引起IR［1］。研究表明在肥胖者體內(nèi)血漿游離脂肪酸（FFA）的水平是增高的［2］，血漿高水平的FFA顯著影響外周組織細(xì)胞，特別是脂肪細(xì)胞對胰島素的敏感性，使脂肪細(xì)胞糖代謝功能障礙，導(dǎo)致IR［3］。因此，F(xiàn)FA在IR發(fā)病過程中的作用已成為近年來研究的熱點(diǎn)，但用FFA制備體外細(xì)胞IR模型無論方法還是劑量目前還未達(dá)成共識。軟脂酸（PA）是FFA的一種，本實(shí)驗(yàn)旨在探討用PA制備3T3－L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗（IR）模型的方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 3T3－L1前脂肪細(xì)胞株由山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院內(nèi)分泌實(shí)驗(yàn)室凍存。高糖DMEM培養(yǎng)基購自Gibco－BRL（公司；胎牛血清（FCS）購自杭州四季青生物有限公司；3－異丁基－1－甲級黃嘌呤（IBMX）、甲狀腺素（T4）、不含游離脂肪酸的BSA（FAF BSA）、牛血清白蛋白（BSA）、二甲基亞砜（DMSO）、PA均購自Sigma公司；葡萄糖測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化 參考文獻(xiàn)［4］的方法進(jìn)行3T3－L1前脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化操作：在37℃、5%CO2的條件下，3T3－L1前脂肪細(xì)胞在含有10%FCS的高糖DMEM中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合2d后，加入含有0.5mmol／L IBMX、0.25 μmol／L地塞米松、0.2nmol／L甲狀腺素、250nmol／L胰島素和10%FCS的高糖DMEM培養(yǎng)4d，期間換液1次，然后換上含有0.25μmol／L地塞米松、0.2nmol／L甲狀腺素、250nmol／L胰島素和10%FCS的高糖DMEM培養(yǎng)，2d換液1次，誘導(dǎo)分化8 d～12d的3T3－L1前脂肪細(xì)胞90%～95%呈脂肪細(xì)胞表型。用油紅O染色鑒定［5］，細(xì)胞可用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 油紅O染色鑒定3T3－L1脂肪細(xì)胞 油紅O是一種可以特異地和細(xì)胞內(nèi)三酰甘油結(jié)合的紅色染料，與未分化細(xì)胞和細(xì)胞外脂質(zhì)不結(jié)合。步驟如下：吸棄培養(yǎng)板里的分化培養(yǎng)基；1×PBS沖洗細(xì)胞2次或3次；加入10%的甲醛磷酸鹽緩沖液4 mL／孔，室溫固定1h；吸棄固定液；加入油紅O溶液，室溫染色3h；吸棄染色劑；無菌三蒸水沖洗2次，洗去未著色染料；顯微鏡下觀察，照相。

1.2.3 不同濃度的PA干預(yù)3T3－L1脂肪細(xì)胞 參考文獻(xiàn)［6］的方法溶解PA。將3T3－L1前脂肪細(xì)胞接種于6孔板，誘導(dǎo)分化成熟后，換上含有0.2%的FAF BSA的高糖DMEN無血清培養(yǎng)基過夜。依據(jù)PA不同濃度分為0mmol／L PA組（對照組）、0.25mmol／L PA 組、0.5mmol／L PA 組、1.0mmol／L PA組共4組，每組3孔，分別換上含0mmol／L、0.25mmol／L、0.5mmol／L、1.0mmol／L PA 及1%FAF BSA 的高糖 DMEN培養(yǎng)24h，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液，用葡萄糖氧化酶法測定各組細(xì)胞培養(yǎng)液葡萄糖的含量。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組間的比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 3T3－L1脂肪細(xì)胞油紅O染色鑒定 光鏡下，3T3－L1前脂肪細(xì)胞形態(tài)與成纖維細(xì)胞相似，呈長梭型，細(xì)胞內(nèi)沒有脂肪積聚，油紅O染色后細(xì)胞不著色。誘導(dǎo)分化后，細(xì)胞變圓、變亮，細(xì)胞質(zhì)中逐漸出現(xiàn)大量圓形的脂肪滴。誘導(dǎo)分化8d后，90%以上的細(xì)胞呈脂肪細(xì)胞表型，胞漿中積聚大量脂滴。油紅O染色后，可見細(xì)胞質(zhì)內(nèi)脂肪滴被染成紅色。

2.2 PA對3T3－L1脂肪細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的影響 在100 nmol／L INS的作用下，不同濃度的PA作用于3T3－L1脂肪細(xì)胞，0.25mmol／L PA 組、0.5mmol／L PA 組、1.0mmol／L PA組細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖濃度均顯著高于對照組（P＜0.01），0.5 mmol／L PA組較0.25mmol／L PA組顯著升高（P＜0.01），1.0 mmol／L PA組較0.5mmol／L PA組顯著升高（P＜0.01）。詳見 表1。與對照組相比0.25mmol／L PA組、0.5mmol／L PA組、1.0mmol／LPA組葡萄糖攝取率分別下降5.25%、10.29%、14.54%。說明PA具有引起3T3－L1脂肪細(xì)胞產(chǎn)生IR的作用，且1.0mmol／L PA作用于3T3－L1脂肪細(xì)胞24h抑制細(xì)胞葡萄糖攝取的效果最顯著。

表1 PA對3T3－L1脂肪細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的影響（±s） mmol／L

表1 PA對3T3－L1脂肪細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的影響（±s） mmol／L

組別 n 培養(yǎng)液葡萄糖濃度對照組3 10.77±0.21 0.25mmol／L PA組 3 12.03±0.271）0.5mmol／L PA 組 3 13.24±0.201）2）1.0mmol／L PA 組 3 14.26±0.231）2）3）與對照組比較，1）P＜0.01；與0.25mmol／L PA組比較，2）P＜0.01；與0.5mmol／L PA組比較，3）P＜0.01

3 討 論

FFA導(dǎo)致IR的主要機(jī)制有：抑制糖代謝中的相關(guān)酶，如丙酮酸脫氫酶、磷酸果糖激酶等，抑制糖攝取［7］；長期高FFA可使骨骼肌及脂肪細(xì)胞GLUT－4mRNA及蛋白水平減少，并使其轉(zhuǎn)位減少，導(dǎo)致葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)障礙［8，9］；在長期高FFA的刺激下，可導(dǎo)致胰島β細(xì)胞凋亡［10］；高FFA可使胰島素信號通路上IRS－1絲氨酸殘基磷酸化增加而酪氨酸磷酸化減少；PI3K活性受抑制，引起葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，導(dǎo)致IR［11］。因此如前所述，F(xiàn)FA在IR發(fā)病過程中的作用已成為近年來研究的熱點(diǎn)，但用FFA制備體外細(xì)胞IR模型的方法未達(dá)共識：一方面FFA種類較多，另一方面不同種類制備體外細(xì)胞IR模型的濃度還未達(dá)成共識。

本研究選用PA制模，摸索其合適的干預(yù)濃度。有研究表明，PA 在低濃度（0.2mmol／L、0.3mmol／L）時(shí)就可明顯抑制3T3－L1成熟脂肪細(xì)胞的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)［12，13］，但溫宇等［14］報(bào)道，PA濃度達(dá)到1.0mmol／L時(shí)才可明顯抑制3T3－L1成熟脂肪細(xì)胞胰島素刺激下葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)。因此，用PA制備IR模型的濃度不確定。在胰島素刺激下與空白對照組相比，細(xì)胞的糖攝取下降，就說明已經(jīng)產(chǎn)生了IR。本研究結(jié)果顯示，在100nmol／L INS的作用下，不同濃度的PA作用于3T3－L1成熟的脂肪細(xì)胞，與對照組相比各實(shí)驗(yàn)組均可抑制葡萄糖的吸收，PA濃度為0.25mmol／L時(shí)就可明顯抑制3T3－L1脂肪細(xì)胞的糖攝取，且隨著PA濃度的增加，其抑制作用逐漸增強(qiáng)。1.0mmol／L PA抑制效果達(dá)到了14.54%。說明0.25mmol／L PA作用于3T3－L1脂肪細(xì)胞24h就可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生IR，且隨著濃度的增加其效果逐漸增強(qiáng)。這為用PA制備3T3－L1脂肪細(xì)胞IR模型提供了一種方法和濃度參考。

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