響應(yīng)面法優(yōu)化款冬花總鞣質(zhì)提取工藝的研究

任雪峰，吳冬青，林 敏，宋 海，溫 娜，安紅鋼，*

（1.河西學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，甘肅張掖734000；2.甘肅省高校河西走廊特色資源利用省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅張掖734000）

響應(yīng)面法優(yōu)化款冬花總鞣質(zhì)提取工藝的研究

任雪峰1，2，吳冬青1，2，林 敏1，2，宋 海1，2，溫 娜1，安紅鋼1，2，*

（1.河西學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，甘肅張掖734000；2.甘肅省高校河西走廊特色資源利用省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅張掖734000）

目的：優(yōu)選款冬花總鞣質(zhì)的提取工藝。方法：采用響應(yīng)曲面法優(yōu)選款冬花中鞣質(zhì)的最佳條件，以提取率為指標(biāo)，采用EDTA絡(luò)合滴定法測(cè)定提取率。結(jié)果：款冬花總鞣質(zhì)提取的最佳工藝為：丙酮濃度為31%，提取溫度30℃，料液比1∶12，提取時(shí)間167min。在此條件下，款冬花總鞣質(zhì)的提取率可達(dá)14.97%，RSD（n=5）為0.63%，與預(yù)測(cè)值15.26%十分接近。結(jié)論：該工藝提取冬花中總鞣質(zhì)是可行的。

款冬花，鞣質(zhì)，響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)，EDTA

Abstract：EDTA complexing titration was used and extraction ratio was taken as the index with the method of Flos Farfarae to analyze the optimum extraction conditions，the influence factor were also investigated and identified as acetone concentration 31%，solid to liquid ratio 1∶12，extraction temperature 30℃ and extraction time 167min.The results showed that under the optimum extraction conditions the experimental value was 14.97%（RSD（n=5）），which was similar to the predicted value of extraction rate of tannins（15.26%），and the method was work fine.

Key words：Flos Farfarae；tannins；response surface methodology（RSM）；EDTA

款冬花（Flos Farfarae）為菊科（Compositae）植物款冬（Tussilago farfara.L）的干燥花蕾[1]，主產(chǎn)于甘肅、河南、陜西、山西等地，性溫，味辛，微苦，歸脾經(jīng)，具有潤肺下氣，止咳化痰之功效[2]。近代醫(yī)學(xué)研究表明，款冬花有明顯的支氣管解痙、中樞興奮、呼吸興奮和抗炎等作用[3]。其主要化學(xué)成分為蘆丁、槲皮素、款冬酮、款冬二醇等[4]。鞣質(zhì)是一類具有沉淀蛋白質(zhì)特性水溶性多酚類化合物[5]，廣泛存在于植物界。約70%以上的中草藥中含鞣質(zhì)類化合物，鞣質(zhì)在過去常作為雜質(zhì)除去，近代毒理學(xué)和藥理學(xué)研究表明，鞣質(zhì)具有明顯體外抑菌、抗脂質(zhì)氧化、止痛止血、抗腫瘤、抗癌變等功效[6]，引起了國內(nèi)外廣泛關(guān)注[7-12]。目前，鞣質(zhì)的提取方法主要有超聲提取法[13]、回流提取[14]、浸提法[15]。實(shí)驗(yàn)運(yùn)用響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案，采取EDTA滴定法，以款冬花提取液中總鞣質(zhì)含量為指標(biāo)，考察影響鞣質(zhì)提取的因素，優(yōu)化了各種提取工藝的條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

款冬花 采自甘肅省隴西市，將款冬花先經(jīng)自來水、蒸餾水洗凈，置于40℃烘箱中烘干至恒重，粉碎過60目篩，備用；EDTA、丙酮、乙酸鋅、氨-氯化銨緩沖溶液（pH10.0）、濃氨水、鉻黑T等試劑 均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水 為三次水；所用儀器均經(jīng)自來水、三次水清洗備用。

GB204電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋天津市泰斯特儀器有限公司；800型離心沉淀器 上海手術(shù)器械十廠；YLD-2100電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海瑯玕實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鞣質(zhì)提取工藝流程 款冬花→洗凈→晾干→粉碎→烘干至恒重→加入一定量丙酮水溶液→回流提取→抽濾→濾液→定容→得鞣質(zhì)待測(cè)液

1.2.2 鞣質(zhì)的測(cè)定原理 利用Zn2+只與鞣質(zhì)反應(yīng)的特性，用Zn2+沉淀分析溶液中的鞣質(zhì)，剩余Zn2+以鉻黑T作指示劑，以EDTA·2Na溶液滴定。

1.2.3 絡(luò)合法測(cè)定鞣質(zhì)提取率[16]量取50.00mL提取液于250mL錐形瓶中，加水約至150mL，置（35±2）℃水浴中預(yù)熱5min。精確量取10.00mL 1mol/L醋酸鋅溶液于上述錐形瓶中，再加入7mL氨水，搖勻使白色沉淀溶解，反應(yīng)30min間歇攪拌數(shù)次，待反應(yīng)完畢，冷卻至室溫，定容至250mL容量瓶中，抽濾。移取上述溶液20.00mL于250mL錐形瓶中，加50mL水、12.5mL氯化銨-氨水緩沖液（pH10.0）和三滴鉻黑T，以0.02mol/L EDTA滴定至溶液由酒紅色變成暗綠色?？傳焚|(zhì)提取率按下式計(jì)算：

總鞣質(zhì)提取率（%）=（10×CZn-12.5×CEDTA×V）×0.1556/G×100

式中：0.1556—實(shí)驗(yàn)常數(shù)；CZn—醋酸鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（mol/L）；CEDTA—EDTA·2Na標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（mol/L）；V—校正后的EDTA·2Na標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定消耗量（mL）；G—款冬花樣品質(zhì)量（g）。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)[17-18]在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，進(jìn)一步進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，選擇丙酮濃度、料液比、提取溫度及提取時(shí)間為自變量，款冬花總鞣質(zhì)提取率為響應(yīng)值，確定各因素對(duì)款冬花總鞣質(zhì)含量影響的顯著性和各提取條件的最佳組合，其水平編碼表見表1。

表1 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)的因素水平編碼Table 1 Factors and levels of RSM

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 丙酮濃度對(duì)提取效果的影響 稱取一定量款冬花，固定提取時(shí)間為2h，提取溫度為30℃，料液比為1∶20，以丙酮濃度為單因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，丙酮濃度分別為10%、20%、30%、40%、50%、60%。回流兩次，合并濾液，定容在250mL的容量瓶中，按1.2.3測(cè)定鞣質(zhì)提取率。由圖1可以看出，隨著丙酮濃度的升高，款冬花提取率不斷提高，丙酮濃度繼續(xù)升高則鞣質(zhì)的提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，主要是因?yàn)轺焚|(zhì)為多羥基化合物，具有較強(qiáng)極性，丙酮濃度升高導(dǎo)致溶劑極性下降，致使提取率呈下降趨勢(shì)。因此選擇丙酮濃度為30%。

圖1 丙酮濃度對(duì)鞣質(zhì)提取率的影響Fig.1 Effect of acteone concentration on extraction rate of tannins

2.1.2 提取溫度對(duì)提取效果的影響 稱取一定量款冬花，固定丙酮濃度為30%，提取時(shí)間為2h，料液比為1∶20，以提取溫度為單因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，提取溫度分別為10、20、30、40、50℃，回流兩次，合并濾液，在250mL的容量瓶中定容，按1.2.3測(cè)定鞣質(zhì)提取率。由圖2可以看出，當(dāng)提取溫度為30℃時(shí)，款冬花鞣質(zhì)的提取率最高，繼續(xù)提取則鞣質(zhì)的提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這可能是由于提取溫度稍高，導(dǎo)致鞣質(zhì)被氧化而造成的，因此選擇提取溫度為30℃。

圖2 提取溫度對(duì)鞣質(zhì)提取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction rate of tannins

2.1.3 料液比對(duì)提取效果的影響 稱取一定量款冬花，固定提取時(shí)間為2h，提取溫度為30℃，丙酮濃度為30%，以料液比為單因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，料液比分別為1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12，回流兩次，合并濾液，在250mL的容量瓶中定容，按1.2.3測(cè)定鞣質(zhì)提取率。由圖3可以看出，料液比為1∶10時(shí)提取效果最佳。分析原因可能是液料比太小，溶劑不足以溶解足夠多的鞣質(zhì)，而當(dāng)固液比增加到一定程度時(shí)，原料內(nèi)部與溶劑之間溶質(zhì)已經(jīng)達(dá)到平衡，反而使雜質(zhì)溶解增加，相應(yīng)減少鞣質(zhì)的提取率。

圖3 料液比對(duì)鞣質(zhì)提取率的影響Fig.3 Effect of solid to liquid ratio on extraction rate of tannins

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響 稱取一定量款冬花，固定丙酮濃度為30%，提取溫度為30℃，料液比為1∶10，以提取時(shí)間為單因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，提取時(shí)間分別為60、90、120、150、180、210min，回流兩次，合并濾液，定容在250mL的容量瓶中，按1.2.3測(cè)定鞣質(zhì)提取率。由圖4可以看出，提取時(shí)間為180min時(shí)提取效果最佳。這可能是回流時(shí)間太長(zhǎng)，有部分丙酮被揮發(fā)而導(dǎo)致沸點(diǎn)逐漸增大，從而破壞某些鞣質(zhì)所導(dǎo)致。

2.2 款冬花總鞣質(zhì)提取方法的響應(yīng)面優(yōu)化

按照Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行了四因素三水平實(shí)驗(yàn)，以鞣質(zhì)提取率為指標(biāo)，研究各因素間相互作用下的提取率值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

圖4 提取時(shí)間對(duì)鞣質(zhì)提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of tannins

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental design of RSM and results

表2中6～29為析因?qū)嶒?yàn)，1～5為中心實(shí)驗(yàn)。29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)分為析因點(diǎn)和零點(diǎn)，其中析因點(diǎn)為自變量取值在X1、X2、X3、X4所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，用來估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差[19]。

2.3 響應(yīng)面分析與優(yōu)化

采用Design-expert 7.1.6軟件對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式擬合回歸，建立多元二次響應(yīng)面回歸模型：

Y=14.47-0.054X1+1.07X2+0.30X3-0.97X4-0.43X1X2+0.37X1X3+0.043X1X4-0.25X2X3+1.78X2X4-0.15X3X4-2.02X12-4.31X22+0.25X32-1.26X42

因素的ANOVA分析結(jié)果見表3。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression

由表3可看出，模型的“Prob＞F”值小于0.0001，表明二次方程擬合極顯著，失擬項(xiàng)F值大于0.05，表明失擬項(xiàng)相對(duì)于絕對(duì)誤差是不顯著的。決定系數(shù)為R2=0.9805，校正系數(shù)為R2=0.9601。也說明回歸方程的擬合程度很好，失擬較小。變異系數(shù)CV值越低，顯示實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性越好[14]。從表3中的p值可知，方程中X2、X4、X2X4、X12、X22、X42對(duì)Y值的影響極其顯著（p＜0.01），這與模擬回歸預(yù)測(cè)吻合。綜上所述，該回歸方程為優(yōu)化款冬花鞣質(zhì)的提取工藝條件提供了一個(gè)良好的模型，可以利用該回歸方程確定最佳提取工藝條件。

圖5 各參數(shù)的響應(yīng)曲面圖Fig.5 Response surface indicating the effects of acteone concentration，extraction temperature，solid to liquid ratio and extraction time and their pairwise interactions on tannins yield

圖5是根據(jù)回歸方程所繪制的響應(yīng)面圖，他們能直觀地描述兩個(gè)因素之間對(duì)響應(yīng)值的交互作用。從圖5中可以看出，提取溫度和提取時(shí)間交互作用顯著，表現(xiàn)為曲線比較陡峭。四個(gè)因素對(duì)于款冬花總鞣質(zhì)提取率的影響順序?yàn)椋篨2＞X4＞X3＞X1，即提取溫度影響最大，提取時(shí)間次之，料液比再次之，最后為丙酮濃度影響。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)所得的回歸模型，由Design Expert 7.1.6軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)一步優(yōu)化，可以得出最優(yōu)條件為：丙酮濃度為30.71%，提取溫度30.01℃，料液比1∶12，提取時(shí)間166.81min，在此條件下，款冬花總鞣質(zhì)提取率理論上可達(dá)15.28%。考慮到實(shí)際操作的可行性，將最佳條件在回歸方程得到的理論值基礎(chǔ)上修正為：丙酮濃度31%，提取溫度30℃，提取時(shí)間167min，料液比為1∶12，款冬花總鞣質(zhì)提取率修正為15.26%。在此條件下進(jìn)行五次平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得的款冬花總鞣質(zhì)提取率為14.97%，與修正條件后理論值相差1.90%，且五次提取的RSD=0.63%，說明采用響應(yīng)面法得到的工藝參數(shù)可靠，具有一定的實(shí)際價(jià)值。

3 結(jié)論

3.1 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化款冬花總鞣質(zhì)的提取工藝。結(jié)果表明：提取溫度、提取時(shí)間、丙酮濃度二次方項(xiàng)、提取溫度二次方項(xiàng)、提取時(shí)間二次方項(xiàng)及提取溫度和提取時(shí)間交互作用對(duì)款冬花總鞣質(zhì)提取率的影響極顯著（p＜0.01），說明丙酮濃度、提取溫度、料液比和提取時(shí)間在款冬花總鞣質(zhì)的提取率影響中不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，而是存在交互作用。

3.2 回歸分析及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確、可行?？疃傳焚|(zhì)提取的最佳條件為：丙酮濃度為31%，提取溫度30℃，料液比1∶12，提取時(shí)間167min。在此條件下，款冬花總鞣質(zhì)的提取率可達(dá)14.97%，RSD（n=5）為0.63%。

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Optimization of extraction technique of tannins from Flos Farfarae by response surface methodology

REN Xue-feng1，2，WU Dong-qing1，2，LIN Min1，2，SONG Hai1，2，WEN Na1，AN Hong-gang1，2，*
（1.College of Chemistry and Chemical Engineering，Hexi University，Zhangye 734000，China；2.Key Laboratory Hexi Corridor Resources Utilization of Gansu Provinical University，Zhangye 734000，China）

TS201.1

B

1002-0306（2012）16-0292-04

2011－12－23 *通訊聯(lián)系人

任雪峰（1976-），男，副教授，研究方向：天然產(chǎn)物有效成分提取與分離純化。

甘肅省高校河西走廊特色資源利用省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（XZ-1008）；河西學(xué)院青年基金（201031）資助項(xiàng)目；河西學(xué)院青年骨干教師資助項(xiàng)目。