大孔樹脂吸附分離蠶蛹ACE抑制肽的研究

李 勇，黃先智，闞建全，*，何 錦，張海娜

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.重慶市農產品加工及貯藏重點實驗室，重慶 400715；3.西南大學生物技術學院，重慶 400715；4.西南大學藥學院，重慶 400715）

大孔樹脂吸附分離蠶蛹ACE抑制肽的研究

李 勇1，2，黃先智3，闞建全1，2，*，何 錦1，2，張海娜4

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.重慶市農產品加工及貯藏重點實驗室，重慶 400715；3.西南大學生物技術學院，重慶 400715；4.西南大學藥學院，重慶 400715）

為了找出大孔樹脂純化蠶蛹ACE抑制肽的方法。比較了5種大孔樹脂在純化蠶蛹ACE抑制肽時的吸附率和解吸率，得出DA201-C分離蠶蛹ACE抑制肽的效果最好。再進一步考察上樣流速、上樣濃度、分級洗脫等對DA201-C大孔樹脂吸附及分離效果的影響。最終結果為75%乙醇洗脫下的多肽的ACE抑制率最高，其IC50為0.632mg/mL，并且發(fā)現(xiàn)疏水性與ACE抑制率呈正相關。

大孔樹脂，DA201-C，ACE抑制肽，疏水值

Abstract：The purpose of this experiment was to find out the method of macroporous resin purifying pupa ACE inhibitory peptides.Through comparing the absorption rate and desorption rate of 5 kinds of macroporous resins in purifying pupa ACE inhibitory peptides，it was the result that DA201-C had the best effect in purifying pupa ACE inhibitory peptides.Further research of the impact of sample’s flow，concentration and graded elution on macroporous resin’s separating effect.The final conclusions were that when the ethanol elution concentration was 75%，the eluent had the highest ACE inhibition rate，whose IC50was 0.632mg/mL and it was found that hydrophobicity and ACE inhibition rate were positively correlated.

Key words：macroporous resin；DA201-C；ACE inhibitory peptides；hydrophobicity

大孔吸附樹脂是一類新型非離子型高分子吸附劑，具有吸附能力大，容易再生，機械強度高等特點。大孔樹脂主要通過分子間作用力如范德華力或氫鍵等對溶液中的分子進行吸附，用不同極性的洗脫溶液，就可得到不同極性大小和不同生物活性的組分。趙駿[1]等利用大孔樹脂純化乳酪蛋白源ACE抑制肽。周存山[2]等使用大孔樹脂對麥胚蛋白降壓肽進行脫鹽處理。大孔樹脂在分離純化蛋白質、多肽和氨基酸等生物活性物質時具有條件溫和、設備簡單和操作方便的特性，有利于多肽的進一步純化[3-4]。ACE抑制肽通過抑制人體腎素——血管緊張素系統(tǒng)中血管緊張素Ⅱ的生成而使血壓降低?，F(xiàn)因ACE抑制肽無毒副作用、來源廣泛、效果明顯的特點，目前已成為國內外研究的熱點[5-7]。實驗前期工作已用脫脂蠶蛹蛋白在堿性蛋白酶的作用下酶解，得到蠶蛹多肽液。為了進一步明確具有較高ACE抑制率多肽的性質，采用大孔吸附樹脂分離蠶蛹多肽。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

5種大孔樹脂 滄州寶恩化工有限公司；Alcalase蛋白酶（20萬U/g） 南寧東恒華道生物科技有限公司；ACE、HHL Sigma公司；乙腈（色譜純）、氫氧化鈉（分析純）、鹽酸（分析純） 成都科龍化工試劑廠。

HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；LC-20AD型高效液相色譜儀、UV-2450PC型紫外可見分光光度計 日本SHIMADZU公司；ALPAAI-4LSC型真空冷凍干燥機 德國Sigma公司；DBS-100型電腦全自動部分收集器、HL-2型恒流泵上海滬西分析儀器廠；MiLLi-Qbiocel超純水機 美國密理博公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大孔樹脂的預處理 用無水乙醇浸泡處理24h后，抽濾，用無水乙醇淋洗至流出液遇水不產生白色渾濁，再用水洗盡乙醇。用3～5倍體積的5%HCl浸泡3h后，放盡酸液，用水洗至pH5～7；再用3～5倍的5%NaOH浸泡3h后，放盡堿液，水洗至中性，備用。

1.2.2 蠶蛹多肽的制備 取10g脫脂蠶蛹（采用索氏抽提：無水乙醚抽提12h）配制成12%底物，再用1mol/L的NaOH調節(jié)pH為9.5，再按照7%的加酶量加入堿性蛋白酶進行反應，保持溫度穩(wěn)定在50℃，酶解過程中不斷滴加1mol/L的NaOH維持pH穩(wěn)定。4h后停止反應，沸水浴10min后迅速冷卻滅酶，5℃、8000r/min離心10min，收集上清液（其IC50為1.32mg/mL），冷凍干燥備用。

1.2.3 大孔樹脂類型的選擇 考慮D101、AB-8、DA201-C、HPD-400、HPD-826五種大孔樹脂對蠶蛹多肽分離效果。在250mL具塞錐形瓶中加入5g處理好的干樹脂，再加入10mg/mL的蠶蛹多肽溶液100mL，塞子塞好，在常溫下振蕩器中振蕩（振蕩速度為160次/min），吸附12h后，取出，過濾，測定吸附后濾液中的蛋白含量。再將吸附后的大孔樹脂重新置于250mL具塞錐形瓶中，恒溫振蕩12h，取出，過濾，再測定濾液中的蛋白含量。比較5種樹脂的吸附率和解析率。

1.2.4 DA201-C大孔樹脂靜態(tài)吸附動力學 在250mL具塞錐形瓶中加入5g處理好的干樹脂，再加入10mg/mL的蠶蛹多肽溶液100mL，塞子塞好，在常溫下振蕩器中振蕩（振蕩速度為160次/min），間隔時間取樣，測定溶液中的蛋白含量，計算樹脂的吸附率（%）和吸附量（mg/g）[8]。

吸附率（%）=（原液蛋白濃度-吸附液蛋白濃度）/原液蛋白濃度×100

解析率（%）=（解析液蛋白濃度×解析液體積）/[（原液蛋白濃度-吸附液蛋白濃度）×吸附液體積]×100

吸附量（mg/g）=[（原液蛋白濃度-吸附液蛋白濃度）×溶液體積]/樹脂重量×100

式中：原液蛋白濃度的單位為mg/mL；吸附液濃度的單位為mg/mL；溶液體積的單位為mL；樹脂重量的單位為g。

1.2.5 上樣流速對樹脂吸附的影響 在層析柱中裝滿DA201-C大孔吸附樹脂（2.6cm×50cm）室溫條件下，將濃度為10mg/mL的蠶蛹多肽分別以0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL/min的流速流經層析柱，用紫外檢測器檢測流出液的A280nm，以A280nm=0.05為穿透點，比較不同流速時蠶蛹多肽的穿透體積。

1.2.6 上樣濃度對樹脂吸附的影響 在層析柱中裝滿DA201-C大孔吸附樹脂（2.6cm×50cm）室溫條件下，將濃度為10、30、50mg/mL的蠶蛹多肽以0.5mL/min的流速流經層析柱，用紫外檢測器檢測流出液的A280nm，以A280nm=0.05為穿透點，比較不同濃度時蠶蛹多肽的穿透體積。

1.2.7 DA201-C大孔樹脂分級洗脫 室溫條件下，用濃度為50mg/mL的蠶蛹多肽以0.5mL/min的流速流經層析柱（2.6cm×50cm），用紫外檢測器檢測流出液的A280nm，以A280nm=0.05為穿透點，停止上樣。用純水洗去未吸附的物質，之后分別用25%、50%、75%、100%的乙醇以2.0mL/min的流速流經層析柱，當A280nm吸光值小于0.05的時候停止洗脫，收集各洗脫峰。旋轉蒸發(fā)后冷凍干燥，測定各組分的ACE抑制率。

1.3 分析方法

1.3.1 氨基酸自動分析儀法 GB/T14965-1994。

1.3.2 蛋白質含量測定 半微量凱氏定氮法[9]。

1.3.3 ACE抑制率的測定 采用KUNIO S[10]的馬尿酸高效液相色譜法。在37℃反應體系中依次加入80μL HHL液、降血壓肽液、超純水，每次測試的總體積為0.2mL，把以上混合液放入37℃恒溫水浴中保溫3min，然后加入一定量的ACE酶液（10μL）啟動反應，恒溫保持30min后，加入0.2mL 1mol/L HCl中止反應，至室溫，取5μL反應產物進樣，通過反相高效液相色譜洗脫圖譜定量馬尿酸的生成量，從而計算降血壓肽的抑制率。

式中：S1—不存在降血壓肽時的峰面積，S2—存在降血壓肽與酶時的峰面積。

1.3.4 色譜條件 高壓液相色譜系統(tǒng)：SHIMADZU LC-20AD；檢測器：SPD-M20A；色譜柱：SHIMADZU VP-ODS 4.6mm×150mm；洗脫液：25%乙腈：75%超純水；洗脫液流速：1mL/min；檢測波長：228nm，進樣量：5μL。

1.3.5 蛋白質或多肽疏水值的計算[11]

式中：AAi：100g蛋白質中各種氨基酸的含量，g；Mi：各種氨基酸的摩爾質量，g/mol；ΣAAi/Mi：100g蛋白質中氨基酸的總摩爾數(shù)，mol；△fti：氨基酸側鏈疏水性值，kJ/mol；△Q：蛋白質的疏水性值。

1.4 數(shù)據處理

實驗數(shù)據均是經過3次平行實驗得到的平均值，并計算其誤差，SPSS18.0分析數(shù)據之間的相關性，OriginPro7.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 5種大孔樹脂純化蠶蛹ACE抑制肽對其吸附率和解吸率的比較

從圖1可以看出，DA201-C的吸附率、解吸率都是最大的，其吸附率為45.79%，解吸率為66.43%。D101的吸附率、解吸率和DA201-C的比較接近，所以這兩種樹脂都比較適合用于分離蠶蛹多肽。從表1可以看出D101和DA201-C都是非極性樹脂，但DA201-C的比表面積幾乎是D101的一倍，而比表面積大的樹脂對多肽有較多的吸附位點，有利于提高吸附效率。因此，選擇DA201-C作為實驗所用樹脂。

圖1 五種大孔樹脂的吸附率和解析率的比較Fig.1 The difference of absorption rate and desorption rate of five macroporous resins

表1 DA201-C和D101大孔樹脂的性質Table 1 Properties of DA201-C and D101 macroporous resins

2.2 DA201-C大孔樹脂靜態(tài)吸附動力學曲線

圖2 DA201-C大孔樹脂靜態(tài)吸附動力學曲線Fig.2 Static adsorption kinetics curve of DA201-C to ACE-inhibitory peptide

從圖2可以看出，隨著吸附時間的增加，吸附液的吸光值逐漸降低，在吸附2h達到平衡，整個吸光值呈下降后趨于平緩的趨勢，從而得出DA201-C大孔樹脂對蠶蛹多肽的吸附屬于快速平衡型。其動力學方程為：y=0.032x2-0.180x+0.485，R2=0.943。

2.3 蠶蛹ACE抑制肽的上樣流速對DA201-C樹脂吸附的影響

圖3 上樣流速對大孔樹脂吸附率的影響Fig.3 The effect of flow on macroporous resin’s adsorption rate

從圖3可以看出，流速為0.5mL/min時，其吸附率明顯高于其他4個流速的吸附率，這表示上樣流速越慢，大孔樹脂的吸附效果就越好，但如果流速太慢會增加實驗時間，影響實驗進度，因此應該結合時間和流速一起考慮。本實驗采用0.5mL/min作為蠶蛹ACE抑制肽的上樣流速。

2.4 蠶蛹ACE抑制肽濃度對DA201-C樹脂吸附的影響

從表2可以看出，蠶蛹多肽濃度越高，大孔樹脂的吸附量就越大。由于動態(tài)吸附時間在不超過大孔樹脂吸附容量的情況下，可以選擇較大的濃度上樣。當蠶蛹多肽濃度為50mg/mL時，其動態(tài)吸附量為3250mg；當濃度為55mg/mL時，其動態(tài)吸附量為3135mg，可看出55mg/mL時已超過了大孔樹脂的吸附容量。故本實驗選擇50mg/mL濃度上樣。

表2 不同上樣濃度對樹脂動態(tài)吸附量的影響Table 2 The effect of different concentrations on macroporous resin’s adsorption

2.5 DA201-C大孔樹脂分級洗脫樣品的氨基酸組成及ACE抑制率

由表3可知，隨著洗脫劑乙醇濃度提高，洗脫組分的疏水值也在升高，75%乙醇洗脫組分具有最高的疏水值為5.98kJ/mol、100%乙醇洗脫組分的疏水值雖稍有降低，但與前面較低濃度相比，還是保持在一個較高水平上。與未分離的蠶蛹多肽相比，側鏈疏水值10以上的氨基酸含量均有明顯提高，并且隨著乙醇濃度的提高，其洗脫組分的ACE抑制率也在變化，當乙醇濃度為75%時，其洗脫組分的ACE抑制率最高，達到57.79%（測定ACE抑制率時樣品濃度為0.8mg/mL）。

2.6 乙醇分級洗脫組分疏水性與其ACE抑制率的關系

本實驗進一步考察了各組分的疏水性值與ACE抑制率的關系，其結果見圖4（測定ACE抑制率時樣品濃度為0.8mg/mL）。從圖4中可看出，相對于酶解液，各組分的ACE抑制率都有較大提高，且ACE抑制率隨著多肽的疏水性的增加而變大，75%乙醇洗脫的多肽具有最大的ACE抑制率57.79%。

通過SPSS18.0分析疏水性值與ACE抑制率相關性見表4。從表4中可看出疏水性值與ACE抑制率的相關系數(shù)為0.899，具有顯著相關（p=0.05），這表示疏水性值對蠶蛹多肽的ACE抑制率有較大影響。

表3 酶解液及乙醇梯度洗脫各組分的氨基酸組成、ACE抑制率和其疏水性值（g/100g蛋白）Table 3 Amino acid compositions，ACE inhibition rate and hydrophobicity of hydrolysate and ethanol delute fractions（g/100g protein）

表4 疏水性值與ACE抑制率的關系Table 4 The relationship between hydrophobicity and ACE inhibition rate

2.7 大孔樹脂純化后蠶蛹ACE抑制肽的IC50

將75%乙醇洗脫下的蠶蛹多肽液冷凍干燥成粉，再將其配成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5mg/mL的溶液，再測其ACE抑制率見圖5。

圖5 大孔樹脂純化后樣品的IC50曲線圖Fig.5 The curve of the IC50of samples after the purification of macroporous resin

從圖5得到曲線方程：y=-21.74174x2+76.79228x+10.1188（R2=0.9999），由此可推算出最佳酶解條件的上清液的IC50=0.632mg/mL。

3 結論

綜上所述，DA201-C大孔樹脂可按疏水性的不同對蠶蛹多肽吸附分離。結果表明乙醇濃度在75%時，洗脫下的蠶蛹多肽具有最高的ACE抑制率57.79%，IC50為0.632mg/mL，與未經過大孔樹脂純化的蠶蛹多肽（IC50=1.32mg/mL）比較，其ACE抑制活性有了明顯地提高，并發(fā)現(xiàn)疏水性與ACE抑制率呈正相關。經大孔樹脂純化后的蠶蛹ACE抑制肽還不是單一組分，還需要進一步分離純化。

[1]趙駿，宮霞，郭本恒.乳酪蛋白源ACE抑制肽的分離純化[J].中國乳品工業(yè)，2006，34（6）：8-11.

[2]周存山，馬海樂，余筱潔，等.麥胚蛋白降壓肽的大孔樹脂脫鹽研究[J].食品科學，2006，27（3）：142-145.

[3]Gordon C M.Removal of salts frompurins，pyrimidines and nucleosleds using an XAD-4 resin[J].J of Chromatogr，1982，242：103-110.

[4]Gordon C M.Removal of salts from aromatic amino acids，their metabolites and related compounds using an XAD-4 resin[J].J of Chromatogr，1986，355：193-200.

[5]Fujita H K，Yokoyama M.Classification and antihypenensive activity of angiotensin-I-converting enzyme inhibitory peptides derived from food proteins[J].J Food Sci，2000，65（4）：564-569．

[6]Fitzgerald R J，Meisel H.Milk protein-derived peptide inhibitors of angiotensin-I-converting enzyme[J].British J Nutr，2000，84（1）：33-37.

[7]Wu J P，Ding X L.Hypertensive and physiological effect of angiotensin converting enzyme inhibitory peptides derived from soy protein on spontaneously hypertensive rats[J].Food Chem，2001，49（1）：501-506.

[8]李朝興，印壽根，土克鐳，等.大孔吸附樹脂對絞股藍皂的吸附研究[J].離子交換與吸附，1994，10（3）：203-207.

[9]張水華.食品分析[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2004：97-103.

[10]Kunio S.Isolation and characterization of angiotensin I-converting enzyme inhibitor dipeptides derived from Allium sativum L（garlic）[J].Nutr Biochem，1998（9）：415-419.

[11]Adler-nissen J.Enzymic hydrolysis of food proteins[J].Elsevier Applied Science Publishers，1986（7）：2210-2230.

[12]陳季旺，孫勤，夏文水.魚降壓肽的大孔樹脂分離及其活性穩(wěn)定性[J].食品科學，2009，30（18）：25-28.

Study on macroporous resin’s purification of pupa ACE inhibitory peptides

LI Yong1，2，HUANG Xian-zhi3，KAN Jian-quan1，2，*，HE Jin1，2，ZHANG Hai-na4
（1.College of Food Science，Southwest University，Chongqing 400715，China；2.Chongqing Key Laboratory of Produce Processing and Storage，Chongqing 400715，China；3.College of Biotechnology，Southwest University，Chongqing 400715，China；4.College of Pharmacy，Southwest University，Chongqing 400715，China）

TS201.2

B

1002-0306（2012）16-0281-05

2012－02－13 *通訊聯(lián)系人

李勇（1986-），男，碩士研究生，研究方向：食品化學與營養(yǎng)學。

國家桑蠶產業(yè)技術體系蠶繭綜合利用項目（CARS-22-ZJ0503）。