響應(yīng)面分析法優(yōu)化超高壓提取柿葉單寧的研究

李 亮，顧熟琴，盧大新，楊 冬

（1.北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京 102206；2.農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測與控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京102206）

響應(yīng)面分析法優(yōu)化超高壓提取柿葉單寧的研究

李 亮1，2，顧熟琴1，2，盧大新1，*，楊 冬1，2

（1.北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京 102206；2.農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測與控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京102206）

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法對(duì)柿葉單寧超高壓提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。以總單寧得率為指標(biāo)，考察固液比、提取溶劑濃度、壓力值、保壓時(shí)間對(duì)得率的影響。獲得最佳提取理論條件為：固液比為1∶25（g∶mL），溶液濃度為56.31%，壓力值為222.33MPa，保壓時(shí)間為3min，總單寧得率為96.19%。與溶劑提取法相比，本方法耗時(shí)短，效率高。

超高壓，柿葉單寧，溶液提取，響應(yīng)面分析

Abstract：Based on single factor experiment，the optimal extraction conditions by ultra high pressure extraction process of persimmon tannin were described by response surface method，while the yield of tannins were adopted as indexes.Factors of solid-to-solution ratio，solution concentration，pressure value，and holding pressure time were evaluated for their effects on extraction process.The optimum conditions were as follows：solid-to-solution ratio of 1∶25，solution concentration of 56.31%，pressure value of 222.33MPa，holding pressure time of 3min.The proportion of total persimmon tannin was 96.19%under this conditions.It had time saving and high advantage compared with solvent extraction.

Key words：ultra high pressure；persimmon leaf tannin（PLT）；solvent extraction；response surface method

磨盤柿（Diospyros kakiL.f.cv.Mopan）是北京主栽優(yōu)良柿品種，為澀柿品種，柿果形如磨盤，采收期在10月中旬，品質(zhì)優(yōu)良，在國內(nèi)外均享有盛名。房山區(qū)栽培柿樹歷史悠久，全區(qū)現(xiàn)有磨盤柿8067hm2，占北京市柿樹總面積的70%。柿子葉中所含物質(zhì)原料豐富，其中包含維生素C、單寧、蘆丁、膽堿、黃酮甙、類胡蘿卜素、多種氨基酸及鐵、鋅、鈣等多種對(duì)人體健康有益的營養(yǎng)成分[1]。雖然國內(nèi)外對(duì)其他來源的單寧提取及應(yīng)用有很多研究報(bào)道，但柿子葉中單寧的提取及應(yīng)用卻鮮見文獻(xiàn)報(bào)道[2]。為充分利用現(xiàn)有的柿樹資源，開發(fā)高附加值的柿葉單寧產(chǎn)品，研究如何高效的提取柿葉單寧意義重大。目前，單寧提取較為常見的方法有兩種：一種是超聲波輔助提取法，另一種是鹽酸與乙醇的混合溶劑提取法[3-5]。超高壓技術(shù)作為食品行業(yè)非熱加工技術(shù)一直很受重視，也是一種提取植物原料中有效成分的高新技術(shù)。與傳統(tǒng)提取技術(shù)相比，超高壓具有提取時(shí)間短、能耗低、雜質(zhì)少、“綠色”環(huán)保，且可避免因熱效應(yīng)引起的有效成分結(jié)構(gòu)變化、損失以及生理活性的降低[6-8]。因此，本文采用超高壓技術(shù)提取柿葉單寧，并應(yīng)用響應(yīng)面分析方法研究其提取工藝，分析不同溶液體積分?jǐn)?shù)、超高壓壓力、加壓時(shí)間和固液比對(duì)總單寧得率的影響，并且同溶劑提取進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

柿葉 2010年10月采于北京房山區(qū)磨盤柿柿樹黃葉，室溫通風(fēng)干燥后粉碎至60目、雙層密封袋置于恒溫恒濕箱中保存，在實(shí)驗(yàn)前測定柿葉粉的含水量；單寧標(biāo)準(zhǔn)品 北京偉業(yè)科創(chuàng)科技有限公司單寧標(biāo)準(zhǔn)品（3G）；配制8g/L氨溶液，其他試劑均為分析純。

UHPF/3L/600MPa超高壓設(shè)備 包頭科發(fā)公司；UV9100D紫外可見分光光度計(jì) 北京萊伯泰科儀器有限公司；VORTEX-5漩渦振蕩器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；TD5A—WS臺(tái)式低速離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 超高壓提取柿葉單寧方法 借鑒本超高壓實(shí)驗(yàn)室超高壓處理通用方法，稱取一定量柿葉粉末裝入聚乙烯塑料瓶中（75mL），加入一定濃度的乙醇溶液，盡量排除瓶內(nèi)空氣。用手握住塑料瓶振蕩5次，使其混合均勻。然后放入超高壓萃取釜內(nèi)，設(shè)定條件。塑料瓶中的試樣在超高壓介質(zhì)作用下，單寧滲出到乙醇溶液中。將超高壓處理后的懸濁液轉(zhuǎn)入離心管中，在3000r/min下離心10min，得到上清液。每個(gè)條件做三個(gè)平行，測定所得溶液中單寧含量，并計(jì)算其得率η。

式中：C1-提取液中的單寧濃度，mg/mL；V1-提取液的體積，mL；M-柿葉粉試樣的質(zhì)量，g；ω-柿葉粉試樣中單寧的質(zhì)量百分比。

根據(jù)所測提取液吸光度值，從測定的單寧標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀取相應(yīng)的濃度C1。

1.2.2 溶液提取柿葉單寧 根據(jù)溶劑提取單寧預(yù)實(shí)驗(yàn)的正交分析結(jié)果，按固液比1∶25稱取一定量柿葉粉，加入100mL體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇溶液，在60℃恒溫下提取2.5h，將所得懸濁液倒入離心管，在3000r/min下離心10min，得上清液，并測定所得液中單寧含量[9-10]。做三次平行樣，計(jì)算其得率。

1.2.3 單寧標(biāo)準(zhǔn)曲線制定[11]用單寧標(biāo)準(zhǔn)品配標(biāo)準(zhǔn)溶液（2g/L）。用刻度移液管分別加0、1、2、3、4、5mL單寧酸溶液至20mL容量瓶中，用二甲基甲酚胺補(bǔ)充定容到刻度。得到單寧酸含量為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

用移液管將上述溶液各取1mL移入試管，再加入5mL水及1mL檸檬酸鐵銨溶液，再用振蕩器振蕩5s，然后加1mL氨溶液再用振蕩器振蕩5s。將上述溶液移到測量杯中，靜置（10±1）min后，用分光光度計(jì)于525nm處測定吸光度。以水為空白對(duì)照。

用吸光度作縱坐標(biāo)，用標(biāo)準(zhǔn)刻度上相對(duì)應(yīng)的單寧酸濃度（mg/mL）作橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

圖1 單寧標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of tannin

1.2.4 單寧含量的測量方法[11]采用分光光度計(jì)測定。用移液管取1mL被測溶液放入試管A中，接著用移液管加6mL水與1mL氨溶液，然后用振蕩器振蕩5s。用移液管取1mL被測溶液放入試管B中，接著用移液管加5mL水和1mL檸檬酸鐵銨溶液，用振蕩器振蕩5s，然后用移液管加1mL氨溶液，再用振蕩器振蕩5s。將A、B兩管靜置10min后，用分光光度計(jì)于525nm處測定各自的吸光度，用水做空白對(duì)照。A、B兩管吸光度之差即為所測溶液的吸光度，代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算出對(duì)應(yīng)的濃度值。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn) 以固液比、溶液濃度、壓力值、保壓時(shí)間四因素為自變量，單寧得率為考量值，通過固定其他三個(gè)因素，改變某一因素的取值，確定相關(guān)因素的影響并為后續(xù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供各個(gè)因素的取值范圍[12]。

1.2.6 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果選定各個(gè)因素的零水平和波動(dòng)區(qū)。以單寧得率為響應(yīng)值，考慮超高壓壓力值、保壓時(shí)間、固液比、溶液濃度四因素，設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案。通過Design-Expert軟件設(shè)計(jì)Box-Behnken Design（BBD）實(shí)驗(yàn)[13]。實(shí)驗(yàn)因素與水平的取值見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of response surface test

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 溶液濃度對(duì)單寧得率的影響 在固液比1∶25，壓力值300MPa，保壓時(shí)間3min的條件下，乙醇溶液濃度對(duì)單寧得率的影響如圖2。

圖2 溶液濃度對(duì)單寧得率的影響Fig.2 Effects of solution concentrations on extraction rate

從圖2可以看出，隨溶液濃度的增大，單寧得率先增加后減小。當(dāng)乙醇濃度達(dá)到60%時(shí)，單寧得率最高；當(dāng)乙醇濃度再增加時(shí)，單寧得率反而下降。因此乙醇濃度控制在60%左右比較適宜。

2.1.2 壓力對(duì)單寧得率的影響 在固液比1∶25，保壓時(shí)間3min，乙醇濃度60%的條件下，分別以100、200、300、400、500MPa提取單寧，測得不同條件下所得單寧得率變化如圖3。

如圖3所示，當(dāng)壓力低于200MPa時(shí)，單寧得率隨著壓力值增高有所上升。當(dāng)壓力值到達(dá)200MPa后，單寧得率隨著壓力值的升高呈下降趨勢(shì)。原因是在200MPa以下超高壓處理時(shí)，3min內(nèi)柿葉細(xì)胞的結(jié)構(gòu)還沒有被破壞，乙醇溶液借助高壓滲透進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)萃取出單寧分子，當(dāng)處理的壓力值超過200MPa后，細(xì)胞壁及細(xì)胞膜無法承受3min的超高壓力而被破壞，許多雜質(zhì)滲出影響了單寧分子的提取[14]。

圖3 壓力值對(duì)單寧得率的影響Fig.3 Effect of pressure value on extraction rate

2.1.3 保壓時(shí)間對(duì)單寧得率的影響 在固液比1∶25，壓力值300MPa，溶液濃度60%的條件下，保壓時(shí)間分為1、2、3、4、5min下的單寧提取，結(jié)果如圖4。

圖4 保壓時(shí)間對(duì)單寧得率的影響Fig.4 Effect of holding pressure time on extraction rate

從圖4可以看出，0～2min單寧得率隨保壓時(shí)間上升而增高，保壓時(shí)間2min之后單寧得率開始下降，在3min之后，得率基本沒有變化?？赡苁潜簳r(shí)間達(dá)到3min時(shí)，細(xì)胞組織已經(jīng)無法承受超高壓的作用而被破壞。

2.1.4 固液比對(duì)單寧得率影響 在提取壓力300MPa，保壓時(shí)間3min，溶液濃度60%的條件下，以不同的固液比裝入塑料瓶，固液比依次1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，測得不同條件下的單寧得率如圖5所示。

圖5 固液比對(duì)單寧得率的影響Fig.5 Effect of the solid-to-solution ratio on extraction rate

可以看出，單寧得率是隨固液比的變化而變化，當(dāng)用更多的溶劑去混合物料時(shí)，得率逐漸上升。當(dāng)固液比達(dá)到1∶25之后，單寧得率基本無變化。所以從經(jīng)濟(jì)角度考慮，選擇1∶25的固液比足以滿足提取條件。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 設(shè)計(jì)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案Table 2 Design of response surface method

2.2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 響應(yīng)面分析結(jié)果顯示如表3。

表3 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Test results of response surface analysis

表3分析結(jié)果中，該模型的F值是49.90，表明模型具有顯著性。p值小于0.05表明該因素為顯著因素，小于0.001表明該因素極其顯著。所以因素溶液濃度極其顯著，保壓時(shí)間及B2具有顯著性，但是四個(gè)因素之間的交互作用不顯著。分析可得二次方程為：

單寧得率=90.97-2.27A-4.75B+1.69C+3.05D+2.65AB+1.44AC+1.71AD+1.03B C+1.77BD-0.44CD-2.08A2-3.72B2-1.92C2+1.48D2

2.2.3 各因素之間交互作用 圖6～圖8反映了固液比與溶液濃度、溶液濃度與保壓時(shí)間、壓力值與保壓時(shí)間之間的交互作用。

圖6 固液比、溶液濃度響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface for effects of the solid-to-solution ratio and solution concentration on extraction rate of PLT

圖7 溶液濃度、保壓時(shí)間響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface for effects of solution concentration and holding pressure time on extraction rate of PLT

圖8 壓力值、保壓時(shí)間響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface for effects of pressure value and holding pressure time on extraction rate of PLT

2.3 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面模型得出最優(yōu)化的條件如下：壓力值為222.33MPa（取220MPa），保壓時(shí)間3min，溶液濃度為56.31%（取56%），固液比為1∶25，經(jīng)三次平行實(shí)驗(yàn)測得單寧得率為95.73%，與理論值96.19%接近。

2.4 超高壓提取與溶劑提取對(duì)比

溶劑提取柿葉單寧結(jié)果與超高壓提取結(jié)果對(duì)比，見表4。

從表4可以看出，超高壓提取柿葉單寧，不僅耗時(shí)短，提取效果也明顯高于溶劑提取。

表4 與溶劑提取方法比較Table 4 Compared with the solvent extraction method

3 結(jié)論

超高壓提取柿葉單寧，耗時(shí)短并且得率高，是一種不錯(cuò)的選擇。最佳的提取條件為：乙醇濃度56.31%，固液比1∶25（g∶mL），保壓時(shí)間3min，壓力值222.33MPa，理論得率可達(dá)到96.19%。

超高壓作為新興提取技術(shù)尚未得到廣泛應(yīng)用，超高壓設(shè)備的技術(shù)革新也有待進(jìn)一步發(fā)展，相信超高壓加工技術(shù)的進(jìn)一步提升，一定能給有效成分提取工業(yè)帶來極大的幫助，也能為市場提供更多更好的新產(chǎn)品。

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Optimization of ultra high pressure extraction of persimmon leaf tannin by response surface method

LI Liang1，2，GU Shu-qin1，2，LU Da-xin1，*，YANG Dong1，2
（1.Faculty of Food Science and Engineering，Beijing University of Agriculture，Beijing 102206，China；2.Beijing Key Laboratory of Agricultural Product Detection and Control of Spoilage Organisms and Pesticide Residue，Beijing 102206，China）

TS201.1

B

1002-0306（2012）13-0273-04

2011－12－05 *通訊聯(lián)系人

李亮（1984-），男，在讀碩士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。