大鼠佐劑性關節(jié)炎模型表現(xiàn)特征及評價指標①

李培培 解國雄 宋珊珊 黃 蓓 吳育晶 汪慶童 常 艷 張運芳 周愛武 劉麗華 張玲玲 魏 偉

(安徽醫(yī)科大學臨床藥理研究所抗炎免疫藥理學教育部重點實驗室抗炎免疫藥物安徽省工程技術研究中心，合肥230032)

類風濕關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是以損害滑膜、軟骨和骨的一種慢性、炎癥性自身免疫疾?。?］。大鼠佐劑性關節(jié)炎(Adjuvant arthritis，AA)模型在臨床表現(xiàn)、病理學、免疫學改變和病理機制等方面與人RA有許多相似特征，是研究RA病理機制和評價治療RA藥物的較理想動物模型［2］。本文成功建立了大鼠AA模型，從整體和關節(jié)局部詳細描述了大鼠AA模型的炎癥表現(xiàn)特征，確立了大鼠AA模型的評價指標，包括全身評分、關節(jié)炎指數、關節(jié)腫脹數、足爪腫脹度、足爪X線攝片、踝關節(jié)病理等，旨在為建立AA模型研究RA病理機制及評價RA治療藥物提供實驗依據。

1 材料與方法

1．1 動物 Sprague-Dawley(SD)大鼠，雄性，清潔級，體重130～170克，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，許可證號碼:SCXK(滬)2008-0016。在恒溫(24±2)℃、光照周期12小時∶12小時環(huán)境中飼養(yǎng)1周后實驗。

1．2 試劑 卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin，BCG):北京生物制品所產品，生產批號:20090324。液體石蠟:天津市化學試劑三廠生產，生產批號:20020928。

1．3 方法

1．3．1 實驗分組 SD大鼠，隨機分為2組，即對照組、模型組，每組10只。

1．3．2 大鼠AA模型的制備 將BCG 80℃水浴滅活1小時，與高壓滅菌的石蠟充分研磨、混勻，制成10 mg/ml完全弗氏佐劑(Complete Freund adjuvant，CFA)，于每只大鼠右后足跖皮內注射CFA 0．1 ml致炎［3］。對照組用生理鹽水同法注射。

1．4 檢測指標

1．4．1 臨床體征評分

(1)全身評分 從炎癥出現(xiàn)后，每隔3～4天進行全身表現(xiàn)評分，評分標準包括:耳:0=無結節(jié)和發(fā)紅癥狀，1=一只耳朵結節(jié)和發(fā)紅癥狀，2=兩只耳朵結節(jié)和發(fā)紅癥狀;鼻:0=無結締組織腫脹，1=明顯結締組織腫脹;尾:0=無結節(jié)，1=有結節(jié);前足爪:0=無腫脹，1=一個前足爪腫脹，2=兩個前足爪腫脹;后足爪:0=無腫脹，1=一個后足爪腫脹，2=兩個后足爪腫脹。每只大鼠最多評8分［4］。

(2)關節(jié)炎指數 從炎癥出現(xiàn)后，每隔3～4天進行關節(jié)炎指數評分，觀察每組大鼠的繼發(fā)病變。每只足爪的關節(jié)炎指數評分標準:0=正常;1=踝關節(jié)出現(xiàn)紅斑和輕微腫脹;2=踝關節(jié)到跖關節(jié)或掌關節(jié)紅斑和輕微腫脹;3=踝關節(jié)到跖趾關節(jié)或掌關節(jié)出現(xiàn)紅斑和中度腫脹;4=踝關節(jié)到趾關節(jié)出現(xiàn)紅斑和重度腫脹。每只大鼠最多評12分［5］。

(3)關節(jié)腫脹數 從炎癥出現(xiàn)后，每隔3～4天計算關節(jié)腫脹數。每只足爪計1個踝關節(jié)(或腕關節(jié))和5個指(趾)關節(jié)，每只大鼠最多24個關節(jié)腫脹［4］。

(4)足爪腫脹度測定 致炎前用足容積測量儀測量每個大鼠左后足(非致炎側)容積，從炎癥出現(xiàn)后，每隔3～4天測量左后足容積，求出繼發(fā)側足爪腫脹度(Δml=︱注射后的足爪容積－注射前的足爪容積︱)［5］。

1．4．2 踝關節(jié)X片 致炎后第35天(d35)將各組大鼠四肢關節(jié)置XR/d型數字化X線成像系統(tǒng)下攝片(KV:40～50 V;mA:100 mA，S:32 ms)，觀察骨質破壞情況。關節(jié)破壞分軟組織腫脹、骨侵蝕和關節(jié)間隙改變三個方面進行評價［6］:

(1)軟組織腫脹 0分=正常;1分=輕微的腫脹;2分=中度腫脹;3分=嚴重腫脹。

(2)骨侵蝕評分 0分=正常;1分=可疑或一個微小局部病灶;2分=二個局部病灶或病灶總表面積≤50%;3分=三個以上的病灶或病灶總表面積＞50%;4分=關節(jié)面完全破壞，或出現(xiàn)骨縮小。

(3)關節(jié)間隙 0分=正常;1分=間隙內出現(xiàn)可疑或一個微小局部病灶;2分=關節(jié)間隙出現(xiàn)狹窄，比正常關節(jié)間隙減少25%至50%;3分=關節(jié)強直或關節(jié)間隙消失。每只大鼠評價兩前足爪和繼發(fā)側后足爪，評分最大值為9。

1．4．3 踝關節(jié)病理學觀察 麻醉后脫臼處死大鼠，剪下后足炎性踝關節(jié)，分別用10%甲醛固定，不同濃度梯度乙醇逐級脫水，石蠟包埋、切片、進行HE染色，Olympus光學顯微鏡觀察組織病理變化，并進行病理評分。踝關節(jié)病理分別從滑膜細胞增殖、細胞侵蝕、血管翳形成、炎癥和骨質侵蝕評分［4］。

(1)滑膜細胞增殖評分:0=無增殖;1=輕微增殖，2～4層滑膜細胞;2=中度增殖，4層以上滑膜細胞;3=滑膜細胞過度增殖，侵蝕軟骨和骨，關節(jié)間隙消失。

(2)細胞侵蝕評分:0=無侵蝕;1=較少的1至2個細胞侵蝕灶;2=2至5個的局部細胞侵蝕灶;3=5個以上廣泛細胞侵蝕到關節(jié)囊。

(3)血管翳評分:0=無改變;1=兩個部位出現(xiàn)血管翳;2=四個部位出現(xiàn)血管翳，伴有軟骨表面的侵蝕;3=四個以上部位出現(xiàn)血管翳或二個部位出現(xiàn)大范圍的血管翳。

(4)炎癥評分:0=正常;1=輕度炎癥，出現(xiàn)1個聚集物或少量散在炎性細胞(T細胞、B細胞、巨噬細胞及漿細胞)浸潤;2=中度炎癥，2個或2個以上的白細胞聚集物;3=重度炎癥，炎細胞大量浸潤，大量白細胞聚集，分散浸潤明顯。

(5)骨質侵蝕評分:0=正常;1=微量侵蝕，1～2個小的淺部位;2=少量侵蝕，1～4個中等大小和深度部位;3=中等侵蝕，5個以上部位，局部侵蝕到骨皮質;4=重度侵蝕，多重損傷，局部或完全侵蝕到骨皮質;5=廣泛損傷，皮質穿透骨長度的25%以上。

1．5 統(tǒng)計學處理 數據分析應用SPSS11．5軟件處理，計量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，P＜0．05被認為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2．1 臨床體征觀察情況 大鼠AA原發(fā)病變主要表現(xiàn)為早期致炎部位的局部炎癥反應，在發(fā)病過程中，大鼠精神萎靡、毛發(fā)失去光澤、多發(fā)性關節(jié)腫脹和活動障礙等。免疫后18小時，右后足爪腫脹達高峰，持續(xù)3天后逐漸減輕，免疫后d8再度腫脹;免疫后d13，模型組大鼠對側足爪開始出現(xiàn)繼發(fā)病變，d15模型大鼠普遍出現(xiàn)足爪紅腫，d19～d28達高峰，且發(fā)病率高達90%以上。表現(xiàn)為對側(左后肢)和前肢的腫脹，耳朵、鼻和尾根部出現(xiàn)“關節(jié)炎”結節(jié)等(圖1)，模型組大鼠在d15全身評分明顯升高，d19～d28達高峰(圖2)。

2．2 AA大鼠關節(jié)炎指數評分情況 第一次免疫后，每隔3天，進行關節(jié)炎指數評分。d11開始，AA大鼠關節(jié)炎指數升高，隨著病程延長，關節(jié)炎指數逐漸升高，d19～d28關節(jié)炎指數達高峰(圖3A、B)。

2．3 AA大鼠足爪腫脹度改變情況 AA大鼠在免疫后d7開始，每隔3天，對各組大鼠進行足爪容積測定，d11開始，與對照組比較，各組AA大鼠足爪腫脹度升高，隨著病程延長，腫脹度逐漸升高，免疫后d35，足爪仍然腫脹明顯。與對照組比較，有顯著性差異(P＜0．01見圖4)。

圖1 肉眼觀察AA大鼠足爪腫脹及全身病變情況Fig．1 Macroscopic observation on paw swelling and global assessment of AA rats

2．4 AA大鼠關節(jié)腫脹數的變化情況 免疫后d11開始，各組AA大鼠關節(jié)腫脹數明顯增加，隨著病程延長，關節(jié)腫脹數逐漸升高，d19～d28 AA大鼠關節(jié)腫脹數達高峰(圖5A、B)。

2．5 AA大鼠四肢關節(jié)X線攝片變化及評分 免疫后d35，進行大鼠四肢踝關節(jié)足爪X線攝片，觀察關節(jié)骨質破壞情況。并從軟組織腫脹、骨侵蝕和關節(jié)間隙三方面進行評分。可見AA模型大鼠繼發(fā)側關節(jié)軟組織腫脹，骨質疏松、骨密度降低，骨侵蝕病灶明顯可見，關節(jié)間隙狹窄甚至消失。軟組織腫脹，骨侵蝕和關節(jié)間隙狹窄評分值，與對照組比較，有顯著性差異(P ＜0．01，圖6A、B)。

2．6 AA大鼠踝關節(jié)病理的影響 HE染色結果表明，正常大鼠關節(jié)滑膜由1～2層襯里細胞覆蓋在結締組織脂肪組織間質的表面構成。AA大鼠可見關節(jié)腔積液，炎性滲出，滑膜細胞增生(3～8層)水腫，血管翳形成，滑膜組織內小血管增生，擴張充血，大量炎細胞浸潤，以淋巴細胞、單核巨噬細胞和漿細胞慢性炎細胞浸潤為主。嚴重者炎性滑膜組織侵犯軟骨表面和軟骨下骨，或者炎性滑膜組織靠近關節(jié)軟骨;部分模型組滑膜組織表面或組織內可見纖維素滲出或纖維素樣壞死物。滑膜增生、細胞浸潤、血管翳、炎癥和骨侵蝕評分值增高，與正常組比較，有顯著性差異(P ＜0.01，圖7A、B)。

圖5 AA大鼠關節(jié)腫脹數的變化Fig．5 Swollen joint count assessment on AA rats

圖6 AA大鼠繼發(fā)側踝關節(jié)足爪X線攝片變化情況Fig．6 The X-ray radiography changes on the AA rats'secondary side ankle joint

圖7 AA大鼠踝關節(jié)病理變化及評分(HE，×100)Fig．7 The change on AA rats ankle joint histopathology and scores(HE，×100)

3 討論

AA是由細菌學家Freund 20世紀50年代創(chuàng)立，又稱弗氏佐劑性關節(jié)炎［7］。AA發(fā)病機制為:結核桿菌是相對分子量為65 kD的熱休克蛋白(HSP65)，與AA大鼠關節(jié)軟骨的自身抗原HSP60有高度相似的保守序列，可以通過分子模擬和交叉反應，激活處于靜止狀態(tài)的針對Ⅱ型膠原為主的淋巴細胞克隆，從而引起自身免疫反應［8］。AA大鼠表現(xiàn)為多發(fā)性外周關節(jié)炎，關節(jié)局部紅腫，嚴重致關節(jié)畸形。病理變化為增生性滑膜炎，關節(jié)軟骨破壞、骨侵蝕，伴有炎性細胞浸潤。這些臨床表現(xiàn)與人RA相似，是篩選和研究治療 RA藥物的較理想模型。

目前我國建立AA模型的大鼠主要是SD大鼠、Wistar大鼠、Lewis大鼠三個品系。有學者報道，上述三種品系大鼠誘導膠原性關節(jié)炎模型，Wistar和SD大鼠發(fā)病率和發(fā)病程度均明顯高于Lewis大鼠，Wistar和SD大鼠發(fā)病率無顯著性差異，但發(fā)病程度SD大鼠明顯高于Wistar大鼠。三種品系大鼠雌雄之間發(fā)病率和發(fā)病程度無明顯差異［9］。

國內外的研究結果從形態(tài)學、血清學、超微結構的變化等多個特征來考察模型的建立情況，結果顯示大鼠AA表現(xiàn)為周圍性關節(jié)炎，關節(jié)腫脹，滑膜充血，水腫，滑膜排列疏松、紊亂，慢性病變則表現(xiàn)為滑膜組織的不規(guī)則增厚，關節(jié)軟骨破壞等［7，10］。本實驗中，我們采用完全弗氏佐劑誘導SD大鼠，成功建立了AA關節(jié)炎模型，結果顯示AA大鼠原發(fā)側和繼發(fā)側足爪及踝關節(jié)腫脹，活動障礙，該模型既有關節(jié)局部的炎癥反應，也有全身表現(xiàn)癥狀，如大鼠精神萎靡、毛發(fā)失去光澤、體重下降、耳朵、鼻和尾根部出現(xiàn)“關節(jié)炎”結節(jié)，且發(fā)病率高達90%左右等。

RA關節(jié)組織破壞的機制十分復雜，成纖維樣滑膜細胞(Fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)是滑膜組織的重要組成成分，通過分泌各種細胞因子、蛋白酶類、花生四烯酸代謝產物等，在關節(jié)破壞過程中發(fā)揮重要作用［11，12］。從其病理特征來看，關節(jié)滑膜和周圍結締組織異常增殖，血管翳的形成是關節(jié)軟骨侵蝕、關節(jié)破壞的主要原因。本研究發(fā)現(xiàn)AA大鼠關節(jié)X線攝片可見關節(jié)軟組織腫脹，骨質疏松、骨密度降低，骨侵蝕病灶明顯可見，關節(jié)間隙狹窄甚至消失;病理學結果表明，AA大鼠滑膜細胞增生，血管翳形成，滑膜組織內小血管增生，擴張充血，大量炎細胞浸潤，嚴重者炎性滑膜組織侵犯軟骨表面和軟骨下骨。

綜上所述，本實驗建立的AA大鼠模型的關節(jié)炎癥表現(xiàn)明顯，其病理改變和體征較大程度反映了RA的發(fā)病情況，關節(jié)炎指數、足爪X線片、踝關節(jié)病理等是評價AA模型的主要指標。本實驗描述的AA大鼠建立方法和主要評價指標，為進一步了解RA發(fā)病機制和評價新藥提供了重要的實驗依據。

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