日本柳杉花粉變應(yīng)原CJP-6的重組表達和免疫反應(yīng)性鑒定①

蔣建國 劉瑞玲 付永鋒 程訓(xùn)佳 (復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，上海200032)

花粉癥是一種嚴(yán)重影響人類健康的過敏反應(yīng)性疾病。在日本，日本柳杉(Cryptomeria japonica)花粉是春季空氣中的主要變應(yīng)原，吸入飄散在空氣中的花粉會引起花粉特異性的IgE產(chǎn)生，導(dǎo)致過敏性鼻炎、過敏性哮喘等過敏反應(yīng)性疾?。?］，而日本柳杉在我國不同地區(qū)的園林中也有大量栽培。

日本柳杉花粉中含有多種變應(yīng)原蛋白，目前有兩種變應(yīng)原研究的比較詳細透徹，已被國際免疫學(xué)會變應(yīng)原命名分會官方認定為主要的變應(yīng)原，一種是具有果膠酶活性的Cry j 1，一種是具有聚甲基半乳糖醛酶活性的Cry j 2［2］。CJP-6是在日本柳杉花粉中被發(fā)現(xiàn)的第3種主要變應(yīng)原，屬于異黃酮還原酶家族，由306個氨基酸組成，具有很高的IgE結(jié)合活性和免疫原性［3］。目前，國內(nèi)臨床主要使用花粉浸提液對花粉癥患者進行診斷和脫敏治療，但浸提液的組分非常復(fù)雜，容易引起診斷的假陽性和過敏反應(yīng)，且難以標(biāo)準(zhǔn)化［4］。利用基因工程技術(shù)制備日本柳杉花粉變應(yīng)原CJP-6，有助于診斷與治療試劑的標(biāo)準(zhǔn)化，促進日本柳杉花粉過敏反應(yīng)性疾病的診斷與治療研究。

本研究通過RT-PCR獲得上海地區(qū)日本柳杉花粉的cDNA，從中克隆和表達了cjp-6基因，并通過Dot blot和ELISA方法檢測其與過敏病人血清中IgE的反應(yīng)性，為過敏性疾病的臨床診斷和治療奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 植物材料 本實驗所采用的植物材料是上海地區(qū)日本柳杉花粉，采摘后于－80℃保存。

1．1．2 菌株和載體 原核表達載體pET-19b購自美國Novagen公司，大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞購自大連 TaKaRa公司，E．coli BL21 Star(DE3)pLysS購自美國Invitrogen公司。

1．1．3 主要實驗材料 Rneasy Total RNA Kit購自德國Qiagen公司，GeneAmp RNA PCR Kit購自美國Perkin-Elmer公司，His結(jié)合樹脂購自 Novagen公司，Taq 酶、100 bp ladder Markers、λHind Ⅲ DNA Markers、DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶 XhoⅠ和BamHⅠ等購自大連TaKaRa公司。引物合成和測序由上海Invitrogen公司完成。本研究所用60份日本柳杉花粉過敏病人的血清由日本東京大學(xué)附屬病院提供，血清由UniCAP檢測證實了其反應(yīng)性，而且UniCAP檢測值在三級以上;60份塵螨過敏患者的血清和60份蒿草過敏患者的血清由天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院的變態(tài)反應(yīng)科提供，UniCAP檢測值在三級以上。

1．2 方法

1．2．1 總 RNA的提取和 cDNA的獲取 按照Rneasy Total RNA試劑盒的使用說明，提取日本柳杉的總RNA，使用GeneAmp RNA PCR Kit進行RTPCR，獲得 cDNA。

1．2．2 引物設(shè)計 根據(jù)GeneBank公布的CJP-6變應(yīng)原(AY028631)mRNA序列設(shè)計引物，并加入XhoⅠ和BamHⅠ酶切位點和保護性堿基。正向引物為5'-CCCTCGAGATGGGAGGAAGTAGGGTT-3'，反向引物為5'-CCGGATCCTCATACAAATGCACTG-3'。

1．2．3 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建 以cDNA為模板，PCR擴增編碼cjp-6的基因片段;將純化的PCR產(chǎn)物以XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切后，插入pET-19b表達載體中，轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109，將菌液涂布于LB瓊脂板(含氨芐青霉素 50 μg/ml，氯霉素 34 μg/ml)，37℃過夜培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒進行雙酶切鑒定和測序鑒定。

1．2．4 重組日本柳杉變應(yīng)原CJP-6的表達 重組質(zhì)粒pET19b-CJP6轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 Star(DE3)pLysS后，涂布于LB瓊脂板，37℃溫箱中培養(yǎng)過夜。挑選單一菌落入1 600 ml LB培養(yǎng)液(含氨芐青霉素50 μg/ml，氯霉素 34 μg/ml)中，37℃ 220 r/min 振搖，培養(yǎng)至 OD600約為0．5時，加入1 mmol/L的IPTG，37℃誘導(dǎo)3小時，4℃ 8 000 r/min離心10分鐘，棄上清，收集細菌沉淀。將沉淀超聲后取其少量，12．5%SDS-PAGE 電泳，觀察結(jié)果。

1．2．5 重組日本柳杉變應(yīng)原CJP-6的純化 參照Novagen公司的His Binding kit使用說明，用His結(jié)合樹脂純化蛋白，純化蛋白以12．5%的SDS-PAGE電泳檢測蛋白純度，DC Protein Assay試劑盒檢測重組蛋白含量，4℃冰箱保存。

1．2．6 Dot blot檢測 參照 Tachibana 等［5］的方法進行Dot blot檢測。將重組日本柳杉變應(yīng)原CJP-6蛋白加樣于硝酸纖維素膜上，室溫干燥后，以含3%牛血清白蛋白的PBS濕盒內(nèi)室溫封閉1小時;加入日本柳杉過敏病人血清(1∶5稀釋)，4℃孵育過夜;加入HRP goat Anti-Human IgE 抗體(1∶250稀釋)，室溫孵育1小時;以DAB顯色，20分鐘后終止反應(yīng)。

1．2．7 ELISA檢測 參照已有文獻［6］稍作修改進行，重組變應(yīng)原以0．05 mol/L、pH9．6的碳酸鹽緩沖液稀釋至 1 μg/ml，每孔用 0．1 ml包被酶標(biāo)板，4℃過夜;日本柳杉、塵螨與蒿草過敏患者血清和正常人血清(1∶5稀釋)4℃孵育過夜;HRP goat Anti-human IgE抗體室溫孵育1小時;最終用OPD顯色，反應(yīng)30分鐘終止反應(yīng)。

2 結(jié)果

2．1 cjp-6基因的擴增 用RNA提取試劑盒提取日本柳杉花粉的總RNA，使用GeneAmp RNA PCR Kit進行RT-PCR，獲得cDNA。以cDNA為模板，用引物通過PCR反應(yīng)擴增出CJP-6蛋白編碼基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示在900 bp左右處有明顯條帶，大小與理論值(921 bp)相符(圖1)。

圖1 cjp-6基因PCR產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳分析Fig．1 2%argarose gel electrophoresis analysis of PCR production of cjp-6 gene

圖2 cjp-6核苷酸序列同源性比較Fig．2 Comparison of nucleotide sequence between cjp-6 with AY028631

圖3 重組變應(yīng)原CJP-6的SDS-PAGE分析圖Fig．3 SDS-PAGE analysis of the recombinant CJP-6 protein

2．2 重組表達載體的構(gòu)建與序列分析 表達載體pET19b-CJP-6經(jīng)XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切，電泳結(jié)果表明目標(biāo)條帶與cjp-6基因片段的PCR產(chǎn)物大小一致，說明成功構(gòu)建了日本柳杉花粉變應(yīng)原CJP-6的重組質(zhì)粒pET19b-CJP-6。對重組質(zhì)粒進行測序鑒定，采用 Vector NTI 10軟件和 GENETYX-MAC Ver13軟件系統(tǒng)推定氨基酸序列，并與GenBank中公布的序列(AY028631)進行比對。CJP-6僅有1個核苷酸位點與AY028631不同(圖2)，而無氨基酸殘基的改變。

圖4 重組變應(yīng)原CJP-6的Dot blot鑒定Fig．4 Dot blot analysis of CJP-6 protein

2．3 重組蛋白CJP-6的表達與純化 以重組質(zhì)粒pET19b-CJP-6轉(zhuǎn)化E．coli BL21 Star(DE3)pLysS，挑取轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)，用IPTG誘導(dǎo)表達3小時，菌體經(jīng)超聲破碎后，進行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示在Mr約為36 kD處有明顯蛋白表達條帶(圖4)，與預(yù)測分子量36．7 kD相符。重組蛋白主要以可溶性形式表達，經(jīng)His結(jié)合樹脂純化后純度可達到95%以上(圖3)。使用DC Protein Assay試劑盒檢測重組蛋白含量，最終結(jié)果表明每升培養(yǎng)液的細菌可制備50 mg日本柳杉CJP-6變應(yīng)原重組蛋白。

2．4 Dot blot檢測 重組CJP-6可與日本柳杉花粉過敏病人血清中的IgE發(fā)生特異性結(jié)合，而與正常人血清中的IgE不反應(yīng)(圖4)。

2．5 ELISA檢測 重組CJP-6與日本柳杉花粉過敏患者血液中的IgE有良好的結(jié)合活性，具有免疫原性和免疫反應(yīng)性，其中有32個患者血清與重組CJP-6反應(yīng)呈陽性，陽性率為53．3%(圖5)。為了解CJP-6與中國過敏性疾病患者，尤其是塵螨和蒿草過敏患者的血清反應(yīng)性，進行ELISA檢測其與IgE的反應(yīng)性，重組變應(yīng)原CJP-6與塵螨過敏患者血清反應(yīng)陽性率為45%，與蒿草花粉過敏患者血清反應(yīng)陽性率為51．6%，其反應(yīng)性的平均值與日本柳杉花粉過敏的患者血清相似(圖6)。

3 討論

花粉過敏性疾病是一種嚴(yán)重危害人類健康的常見病，由日本柳杉花粉引起的過敏性哮喘是日本最嚴(yán)重的過敏性疾病，在春季日本柳杉花粉會誘發(fā)20%以上的日本人出現(xiàn)過敏性哮喘［2，7］。日本柳杉作為重要的綠化樹種，在中國很多地區(qū)都有種植，日本柳杉花粉過敏原有可能成為中國過敏性疾病潛在的過敏原，應(yīng)引起我們重視。而目前，尚未有對日本柳杉花粉過敏性疾病的標(biāo)準(zhǔn)化診斷與脫敏治療試劑，國內(nèi)臨床上主要使用花粉浸提液對花粉癥患者進行診斷和脫敏治療，但花粉浸提液成分很多，影響診斷與治療的準(zhǔn)確性與療效。利用DNA重組技術(shù)制備花粉中的主要變應(yīng)原，具有成分單一、操作簡單的優(yōu)點，將為過敏反應(yīng)性疾病的診斷與治療起重要作用。

日本柳杉花粉含有很多種變應(yīng)原，除公認的Cry j 1和Cry j 2兩種主要變應(yīng)原外，CJP-6是在其提取物中發(fā)現(xiàn)的第三種主要變應(yīng)原，是一種異黃酮還原酶，與同屬于異黃酮還原酶家族的其他變應(yīng)原序列同源性很高。本研究在國內(nèi)首次成功克隆了日本柳杉的cjp-6基因，并成功在原核表達系統(tǒng)中進行表達。本研究中采用的表達載體是pET19b，該表達系統(tǒng)為高表達系統(tǒng)，其產(chǎn)量可達到每升細菌純化50 mg重組變應(yīng)原CJP-6，同時其所表達的重組蛋白N端帶有組氨酸標(biāo)簽，便于蛋白的純化。實驗結(jié)果表明，通過Ni2+親和層析就可以得到純度很高的CJP-6蛋白，為CJP-6生物制劑的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

本研究中，重組變應(yīng)原CJP-6與日本柳杉花粉過敏病人血清反應(yīng)的Dot blot結(jié)果表明重組變應(yīng)原具有很高的IgE結(jié)合活性和免疫原性，可作為對日本柳杉花粉過敏患者進行診斷和特異性免疫治療的候選分子。Kawamoto等［3］報道，以 Western blot檢測15位日本柳杉過敏性患者血清有10位患者與重組變應(yīng)原CJP-6反應(yīng)，血清陽性率為67%。而我們以ELISA檢測了60位日本柳杉過敏病人的血清，其中32份血清中的IgE與重組變應(yīng)原CJP-6的反應(yīng)，其陽性率為53．3%。重組變應(yīng)原CJP-6與日本柳杉花粉過敏患者反應(yīng)陽性率的差異，可能是由于不同的檢測方法所導(dǎo)致。另外，值得注意的是，CJP-6與中國過敏性疾病患者血清反應(yīng)的ELISA檢測結(jié)果表明，塵螨或者蒿草過敏病人血清與重組變應(yīng)原CJP-6的IgE陽性率很高，分別為45%和51．6%，且反應(yīng)性平均值與日本柳杉花粉過敏的患者血清相似。這些結(jié)果說明，塵螨變應(yīng)原和蒿草花粉變應(yīng)原與日本柳杉花粉變應(yīng)原CJP-6存在著交叉反應(yīng)性，這可能是由于花粉變應(yīng)原與塵螨或者蒿草花粉中的變應(yīng)原在氨基酸序列、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)或者蛋白質(zhì)功能等方面具有較大的相似性［8，9］。因而，免疫治療螨類吸入性過敏的制劑是否可以用來治療花粉過敏患者，重組CJP-6是否可以用于治療其他變應(yīng)原過敏患者，從而達到異病同治的目的，還需要做進一步深入的研究。

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