響應面法優(yōu)化Coriolus versicolor ZZH-2產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基

尹將來，劉長根，賈紅華，周 華，韋 萍

（南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，江蘇南京210009）

響應面法優(yōu)化Coriolus versicolor ZZH-2產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基

尹將來，劉長根，賈紅華，周 華*，韋 萍

（南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，江蘇南京210009）

采用響應面法對Coriolus versicolor ZZH-2產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基進行優(yōu)化，首先用Plackett-Burman（PB）法篩選出3個影響較大的重要因素，分別為酵母膏、羧甲基纖維素鈉和L-天冬氨酸。在此基礎上，用最陡爬坡實驗逼近最大響應區(qū)域，并利用中心組合實驗以及響應面分析確定了主要影響因素的最佳條件，即酵母膏13.82g/L、羧甲基纖維素鈉13.29g/L和L-天冬氨酸1.44g/L，在優(yōu)化培養(yǎng)基后漆酶酶活達到9693U/mL，比優(yōu)化前提高了1.7倍，其實驗值與理論值基本相符。

漆酶，響應面法，培養(yǎng)基優(yōu)化

Abstract：In this report，response surface methodology was applied to optimize the fermentation conditions Coriolus versicolor ZZH-2 for Laccase Production.Firstly，Plackett-Burman design was used to select the main factors affecting laccase yield of Coriolus versicolor ZZH-2.The results showed that three factors played important roles in the fermentation conditions，including the concentration of yeast extract，sodium carboxymethyl cellulose（CMC） and L-aspartic acid.The pass of steepest ascent was undertaken to approach the optimal region of the three significant to factors.Then the central composite design and response surface analysis were applied to investigate the mutual interaction between the variables and identify optimal values that bring maximum laccase activity.The activity of laccase increased nearly 1.7 times to 9693U/mL where concentrations of yeast extract，sodium carboxymethyl cellulose（CMC） and L-aspartic acid were at 13.82，13.29 and 1.44g/L.The experimental values agreed with the predicted values.

Key words：laccase；response surface methodology；culture medium optimization

漆酶是一種含銅的多酚氧化酶（p-diphenol oxidase，EC1.10.3.2），與抗壞血酸氧化酶和哺乳動物血漿銅藍蛋白同源，都屬于藍色多銅氧化酶家族[1]。Yoshida[2]最先對漆酶進行了描述，Bertrand[3]確定了它是一種包含金屬的氧化酶。近年來，由于漆酶能對有毒的酚類物質(zhì)起作用，在木質(zhì)素降解、微生物菌體形態(tài)形成等方面的功能，使之在食品工業(yè)、環(huán)境保護、造紙工業(yè)等領域顯示出巨大的研究價值和應用潛力，其在納米生物技術和土壤生物修復等方面的應用也越來越受到重視[4]，成為國內(nèi)外綠色環(huán)保型酶的研究熱點。漆酶在自然界中分布廣泛，在多種植物、真菌、細菌、昆蟲以及少數(shù)高等動物中都有發(fā)現(xiàn)。分泌漆酶的真菌主要集中于擔子菌亞門、子囊菌亞門及半知菌亞門等高等真菌，其中最主要的是擔子菌亞門的白腐真菌[5]。但由于白腐真菌好氧，生長速度慢，產(chǎn)酶周期長等特點，發(fā)酵條件比較苛刻，限制了白腐真菌漆酶的工業(yè)化生產(chǎn)和應用。因此，高酶活漆酶發(fā)酵條件的研究也受到廣泛關注。張?zhí)锾锏萚6]通過對火紅密孔菌發(fā)酵產(chǎn)漆酶營養(yǎng)條件的優(yōu)化，使該菌產(chǎn)漆酶酶活提高38.9%。本研究采用響應面分析法對白腐菌Coriolus versicolor ZZH-2產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基進行優(yōu)化，進一步提高了漆酶的產(chǎn)量和酶活，為實現(xiàn)漆酶的工業(yè)化生產(chǎn)和應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白腐菌Coriolus versicolor ZZH-2 由本實驗室篩選分離保藏；種子培養(yǎng)基（g/L） 麥芽汁30，蛋白胨3，pH5.6；斜面培養(yǎng)基（g/L） 麥芽汁30，蛋白胨3，瓊脂20，pH5.6；發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L） 葡萄糖1.25，羧甲基纖維素鈉（CMC）15，酵母膏15，KH2PO41，MgSO40.25，CaCl20.05，L-天冬氨酸（L-Asp）1，Tween-80 2，CuSO40.5，誘導劑（2，5-二甲基苯胺）0.25，pH4.0。

表1 Plackett-Burman（PB）實驗因素水平設計（g/L）Table 1 Levels design of variables of Plackett-Burman（g/L）

HVE-50型高壓滅菌鍋 日本Hirayama公司；THE-C1臺式冷凍恒溫振蕩器 太倉市實驗設備廠；752型紫外-可見分光光度計 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；GL-21M型冷凍離心機 上海市離心機械研究所。

1.2 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：用滅菌后的竹簽將斜面上的菌絲刮到含有玻璃珠的30mL無菌水中將其打散，然后吸取2mL懸浮液加入裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于25℃、轉(zhuǎn)速為160r/min的條件下，搖床振蕩培養(yǎng)3d。

發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的種子液以4%（體積分數(shù)）的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中（250mL三角瓶中），于30℃、轉(zhuǎn)速為180r/min的條件下，搖床振蕩培養(yǎng)7d。

取適量發(fā)酵液在4℃、轉(zhuǎn)速為10000r/min的條件下離心10min，得到上清液即為漆酶粗酶液。

1.3 漆酶活力測定

采用2，2’-連氮-雙（3-乙基并噻-6-磺酸）（ABTS）法測定酶活力（一個漆酶單位U為每1min轉(zhuǎn)化1μmol ABTS的酶量，使產(chǎn)物ABTS自由基濃度從a增加到b），計算粗酶液的酶活力，計算公式如下[7-8]：

酶活力=1000×0.1884×（A2-A1）×60×稀釋倍數(shù)/t

其中：酶活力單位為U/mL，A2、A1為吸光值變化的兩個端值，t為吸光值從A1增加到A2經(jīng)歷的時間（s），0.1884為ABTS自由基濃度跟吸光值關系曲線的斜率，詳見文獻[8]。

本文以漆酶酶活為響應目標。

1.4 實驗方法

1.4.1 Plackett-Burman（PB）實驗設計 Plackett-Burman（PB）設計[9]是一種經(jīng)濟而有效的二水平實驗設計方法，它用最少的實驗次數(shù)使因子的主要效果盡可能精確的估計，11個二水平變量的PB設計僅需要12次實驗就可以達到良好的效果，且因子間的交互作用僅部分的與主因子發(fā)生混淆[10]。利用PB實驗設計方案篩選出對漆酶酶活影響較大的因素，各因素水平設置見表1。

1.4.2 最陡爬坡實驗 響應面擬合方程只有在考察的臨近區(qū)域里才能充分近似真實情況，因此確定主要因素后，根據(jù)擬合得到一階模型回歸系數(shù)的符號和大小來確定最陡爬坡的路徑，通過使主要因素同時朝響應值增大的方向變化，找出其峰值，從而快速逼近最大響應區(qū)域，再建立有效的擬合方程。

1.4.3 中心組合設計和響應面分析 在對PB實驗結(jié)果充分分析的基礎上，在最陡爬坡實驗確定的區(qū)域內(nèi)，以漆酶比酶活為響應值對數(shù)據(jù)進行二次回歸擬合，得到二次方程，分析各因素的主效應和交互效應，最后在一定的水平范圍內(nèi)求出最佳值。

2 結(jié)果與討論

2.1 Plackett-Burman（PB）實驗設計及分析

以葡萄糖（X1），酵母膏（X2），吐溫80（X3），磷酸二氫鉀（X4），氯化鈣（X5），硫酸鎂（X6），羧甲基纖維素鈉（X7），L-天冬氨酸（X8），硫酸銅（X9），誘導劑（X10）為培養(yǎng)基成分因素，各因素分別取正、負兩水平，正水平為負水平的1.5倍，本實驗選用N=12的PB實驗設計，實驗設計及結(jié)果見表2。采用STATISICA8.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果見表3。

根據(jù)表3的實驗分析數(shù)據(jù)，建立以漆酶比酶活為響應值的多元線性回歸模型，見式（1）。

表2 Plackett-Burman（PB）實驗設計及產(chǎn)漆酶酶活Table 2 Experimental design and response values of Plackett-Burman

表3 Plackett-Burman（PB）實驗因素水平及主要效應分析Table 3 Levels of variables and the main effect analysis of Plackett-Burman

其中Y為漆酶酶活，該模型的復相關系數(shù)R2=0.9990，說明該模型相關性良好；校正決定系數(shù)Adj R2=0.9896，表明98.96%的實驗數(shù)據(jù)的變異性可用此回歸模型來解釋。由表2分析可知，各因素中對漆酶產(chǎn)酶影響顯著（p＜0.05）的因素為酵母膏、羧甲基纖維素鈉和L-天冬氨酸。其中酵母膏和羧甲基纖維素鈉為負效應，而L-天冬氨酸為正效應。

2.2 最陡爬坡實驗分析

根據(jù)PB實驗得到的對產(chǎn)酶影響顯著的因子是酵母膏、羧甲基纖維素鈉和L-天冬氨酸，通過最陡爬坡實驗確定最優(yōu)點的所在范圍，由式（1）確定最陡爬坡的路徑。由表4數(shù)據(jù)可知，產(chǎn)漆酶酶活隨關鍵因素濃度的改變而變化，產(chǎn)量最高的為第3組，比酶活達到10176U/mL，說明該組實驗的酵母膏、羧甲基纖維素鈉和L-天冬氨酸濃度接近最優(yōu)。故選第3組為中心點，用于培養(yǎng)基組成的進一步優(yōu)化。

表4 最陡爬坡實驗設計及結(jié)果Table 4 Experimental design and results of the steepest ascent path experiments

2.3 中心復合實驗及響應面分析

由上述最陡爬坡實驗結(jié)果可知，第3組相應變量值最接近最大響應值區(qū)域，因此選擇第3組的培養(yǎng)基條件為原點進行中心組合實驗設計，中心組合實驗設計及其結(jié)果見表5，結(jié)果分析見表6。

根據(jù)中心組合實驗得到的結(jié)果，對實驗數(shù)據(jù)進行響應面回歸分析，得到以漆酶比酶活為響應值的多元回歸二次擬合模型見式（2）[11]。

表5 中心組合實驗設計及其結(jié)果Table 5 Experimental design and results of central composite design

由表6分析可知，X1、X2、X3、X1X3、X12、X22和X32的p值均小于0.05，表明對漆酶酶活的影響是統(tǒng)計顯著的，在建模時需加以考慮，忽略其中影響不顯著的項，簡化得漆酶產(chǎn)酶預測的二次關聯(lián)表達式為（3）。

式中Y為漆酶比酶活，X1、X2、X3分別為酵母膏、羧甲基纖維素鈉和L-天冬氨酸的編碼值?；貧w模型方差分析結(jié)果見表6，模型p＜0.0001，說明模型在α=0.01水平上回歸達到極顯著；式（2）模型的相關系數(shù)R2=0.9702，調(diào)整后的Adj R2=0.9368，表明方程模型于實驗數(shù)據(jù)有93.68%的符合度，有很高的可信度。圖1～圖3是由多元回歸方程式（2）擬合出的響應曲面圖及其等高線圖，由此可對任何兩因素交互影響漆酶產(chǎn)量進行分析與評價，以確定最佳因素水平范圍[12]。由（圖1～圖3）交互影響的響應面可以看出，X1、X2、X3存在極值點，對式（3）利用STATISICA8.0進行分析，可以得到曲面的最高點，即3個因子的最優(yōu)實驗點（X1、X2、X3）的數(shù)值（13.82、13.29、1.44）。圖1中L-天冬氨酸的量一定的情況下，隨著酵母膏和羧甲基纖維素鈉的量的增加，漆酶酶活開始不斷提高，達到峰值后又開始下降。這是由于酵母膏和羧甲基纖維素鈉的量的增加，可以使菌體更好的生長，從而提高漆酶的產(chǎn)量，但是由于羧甲基纖維素鈉具有一定的粘性，過多的加入會使發(fā)酵液的粘度增大，從而使發(fā)酵液中的溶氧量減少，不利于菌體的生長。圖2中羧甲基纖維素鈉的量一定的情況下，增加酵母膏和L-天冬氨酸的量，漆酶產(chǎn)量先隨之增加，到達最大值后又逐漸下降，這是由于過量的L-天冬氨酸和酵母膏不利于漆酶的生長，酶活降低。圖3表明在酵母膏的量不變的情況下，不斷增加羧甲基纖維素鈉和L-天冬氨酸的量，漆酶酶活先增加后又不斷降低，再次表明過量的羧甲基纖維素鈉和L-天冬氨酸不利于漆酶的分泌。因此，培養(yǎng)基中酵母膏的量為13.82g/L、羧甲基纖維素鈉的量為13.29g/L和L-天冬氨酸的量為1.44g/L，此時漆酶活力達到最高，預測值達9989.6U/mL。因此最佳培養(yǎng)基配方（g/L）：葡萄糖1.25，羧甲基纖維素鈉（CMC）13.29，酵母膏13.82，KH2PO41，MgSO40.25，CaCl20.05，L-天冬氨酸（L-Asp）1.44，Tween-80 2，CuSO40.5，誘導劑（2，5-二甲基苯胺）0.25，pH4.0。經(jīng)實驗驗證，搖瓶發(fā)酵漆酶平均酶活可達9693U/mL，與模型預測值基本相當，表示該模型能很好的預測實際發(fā)酵情況。

表6 回歸模型方差分析Table 6 ANOVA of quadratic polynomial model

圖1 酵母膏和CMC對漆酶酶活交互影響的三維曲面圖Fig.1 Surface of mutual-influence for yeast extract and CMC on the activity of laccase

圖2 酵母膏和L-Asp對漆酶酶活交互影響的三維曲面圖Fig.2 Surface of mutual-influence for yeast extract and L-Asp on the activity of laccase

圖3 L-Asp和CMC對漆酶酶活交互影響的三維曲面圖Fig.3 Surface of mutual-influence for L-Asp and CMC on the activity of laccase

3 結(jié)論

本研究采用響應面分析法對Coriolus versicolor ZZH-2產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，首先用Plackett-Burman法確定了培養(yǎng)基中酵母膏、羧甲基纖維素鈉和L-天冬氨酸這三個顯著因素；然后通過最陡爬坡實驗逼近最佳響應面區(qū)域；最后采用中心組合實驗和STATISICA8.0軟件分析確定出主要因素的最優(yōu)濃度，得到酵母膏、羧甲基纖維素鈉和L-天冬氨酸最佳濃度分別為13.82、13.29、1.44g/L。漆酶酶活從優(yōu)化前的5742U/mL提高到9693U/mL，提高了1.7倍。同時回歸方程的預測值跟驗證值十分相近，說明回歸方程能較真實地反映各篩選因素的影響，為產(chǎn)漆酶研究奠定了一定的基礎。響應面優(yōu)化方法作為一種科學可行的統(tǒng)計分析方法將越來越廣泛的運用于微生物培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化中。

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Medium optimization of Coriolus versicolor ZZH-2 for laccase production by response surface methodology

YIN Jiang-lai，LIU Chang-gen，JIA Hong-hua，ZHOU Hua*，WEI Ping
（College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing University of Technology，Nanjing 210009，China）

TS201.2+5

A

1002-0306（2012）16-0183-04

2011-12-30 *通訊聯(lián)系人

尹將來（1986-），男，碩士研究生，研究方向：生物化工。

國家重點基礎研究發(fā)展計劃（973計劃）資助項目（2009CB724706）；國家自然科學基金資助項目（20906048）。