維藥材小檗果提取物的體外抑菌實驗研究

田 莉，楊 建，田樹革，烏莉婭·沙衣提，吳玲玲

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830011；2.新疆名醫(yī)名方與特色方劑學(xué)重點實驗室，新疆烏魯木齊830011；3.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆烏魯木齊 830011）

維藥材小檗果提取物的體外抑菌實驗研究

田 莉1，2，楊 建3，田樹革2，*，烏莉婭·沙衣提1，吳玲玲1

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830011；2.新疆名醫(yī)名方與特色方劑學(xué)重點實驗室，新疆烏魯木齊830011；3.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆烏魯木齊 830011）

觀察小檗果不同極性提取物的體外抑菌活性。采用微孔板法和對倍稀釋法研究小檗果不同極性提取物對變異鏈球菌和大腸桿菌生長及其生物膜形成的影響。結(jié)果顯示，乙醇、水、乙酸乙酯和正丁醇提取物對變異鏈球菌生物膜的形成有一定抑制作用，其中乙醇和水提取物抑制作用很強(qiáng)；乙酸乙酯提取物對大腸桿菌的生長有一定抑制作用，正丁醇、乙酸乙酯、氯仿提取物對大腸桿菌生物膜的形成有一定抑制作用，其中氯仿提取物的抑制活性最強(qiáng)。小檗果含有有效抑制供試菌生長及其生物膜形成的活性成分，值得進(jìn)一步研究開發(fā)。

小檗果，體外抑菌，生物膜，兩倍稀釋法

Abstract：To study the antibacterial activity of the extracts with different solvent from Fructus berberis.Microwell plate method and double dilution method were used to determine the minimum inhibitory concentration（MIC） of the extracts of Fructus berberis against streptococcus mutans and Escherichia coli.The results showed that the ethanol extrac，water extract，ethyl acetate extract and n-butanol extract could inhibit the formation of biofilm of stretopcoccus mutans.The ethyl acetate extract had certain inhibition on the growth of Escherichia coli.The n-butanol extract，ethyl acetate extract and chloroform extract could inhibit the formation of biofilm of Escherichia coli，especially chloroform extract showed the obviously antibacterial activity.Fructus berberis had obvious antibacterial activity composition and were worth further studying.

Key words：Fructus berberis；antibacterial effect in vitro；biofilm；double dilution method

紅果小檗（Berberis nummularia Bge.）系小檗科植物，是新疆及中亞地區(qū)特有的藥食兼用植物，目前，主要分布于伊犁河流域，在東至鞏留、特克斯縣，西至霍城縣一帶有大量自然茂密生長的紅果小檗資源，其果實屬漿果，是維吾爾族人民喜食的野果之一，其富含維生素、糖類及人體必需的微量元素等營養(yǎng)成分，可以加工成各種果醬和果汁飲料[1-2]。紅果小檗是維吾爾醫(yī)藥的一種常用藥材，其根、根皮、莖及果實均可入藥，小檗果即為其干燥成熟的果實，于秋季采摘，曬干，已收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部標(biāo)準(zhǔn)》（維吾爾藥分冊），具健胃和中，生律止渴，清熱解毒等功能，維醫(yī)臨床用于治療消化不良，痢疾瀉下，口渴，口瘡，咽炎等癥[3-4]。對紅果小檗中生物堿的提取和檢測方法研究已有文獻(xiàn)報道[5]，但藥效研究未見報道。新疆紅果小檗分布面積廣，資源豐富，尚未得到有效開發(fā)利用，極具研究價值。本文采用微孔板法和對倍稀釋法進(jìn)行了小檗果體外抑菌的初步研究，為綜合開發(fā)利用新疆紅果小檗資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小檗果 購于新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)院，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院烏莉婭·沙衣提教授鑒定為紅果小檗的干燥果實；變異鏈球菌（Streptococcus mutans，ATCC 700610）、大腸桿菌（Escherichia coli，ATCC 35218） 均購于中國藥品生物制品檢定所；腦心浸液培養(yǎng)基（Brain Heart Infusion Broth，BHI）、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（Nutrient Broth，NB） 均購于美國BD公司；結(jié)晶紫 購于上海研晶生物科技有限公司，去氧膽酸鈉（Sodium deoxycholate，SD） 購于Sigma-Aldrich公司；其余化學(xué)試劑 均為分析純；實驗用水蒸餾水。

表1 小檗果不同溶劑提取物對變異鏈球菌生長的抑制率（%，Mean±SD，n=4）Table 1 The inhibition rate of different solvent extracts from Fructus berberis on the growth of Streptococcus mutans（%，Mean±SD，n=4）

SPECTRAMAX 190酶標(biāo)儀 美國Molecu1ar Devices公司；YJ-875A醫(yī)用凈化工作臺 蘇州金燕凈化設(shè)備廠；DNP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；3110系列CO2培養(yǎng)箱 美國賽默飛世爾科技公司；YXQ-LS-SI全自動立式電熱壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業(yè)醫(yī)療設(shè)備廠；冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；電子天平 德國賽多利斯公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 小檗果提取物的制備 稱取干燥小檗果粗粉200g，過10目篩，用石油醚1.5L回流提取1.5h后，濾過，濾渣依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇和水1.5L回流提取2h后濾過，均重復(fù)提取三次，濾液分別置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮減壓后得稠浸膏，再經(jīng)冷凍干燥成粉末，均密封冷藏備用。

1.2.2 菌種復(fù)蘇與培養(yǎng) 將變異鏈球菌、大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌種分別置于裝有2mL培養(yǎng)基的有蓋試管中，置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)16h后，經(jīng)比濁法判斷試管變渾濁，說明菌種已復(fù)蘇。

把滅過菌的培養(yǎng)皿和培養(yǎng)基倒平板，冷卻凝固后，用接種針挑取少許待復(fù)蘇后的標(biāo)準(zhǔn)菌種進(jìn)行劃線接種，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，再進(jìn)行活化，使這些菌種有較強(qiáng)的活力[6]。

經(jīng)復(fù)蘇轉(zhuǎn)種培養(yǎng)后，取新傳代大腸桿菌、變異鏈球菌置于已滅菌的裝有2mL培養(yǎng)基的有蓋試管中，加入適量40%葡萄糖，置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h后，培養(yǎng)液用肉湯培養(yǎng)基稀釋，充分振蕩后經(jīng)麥?zhǔn)媳葷峁芊ㄕ{(diào)整菌液濃度為109CFU/mL。

1.2.3 微孔板法篩選抑菌活性 采用96孔微孔板進(jìn)行抑菌活性的快速篩選[7]。分別取變異鏈球菌、大腸桿菌懸液用培養(yǎng)液50倍稀釋，混勻。把維藥材小檗果的不同極性提取物溶解在適宜溶劑中制成2000μg/mL的溶液，經(jīng)微孔濾膜除菌后，在96孔板上用肉湯培養(yǎng)基與大腸桿菌、變異鏈球菌作連續(xù)對倍稀釋，使含藥濃度分別為1000、500、250、125、62.5μg/mL。相同條件下，并設(shè)溶劑對照、僅含菌液的空白對照，同一板重復(fù)4次，共置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18h，以培養(yǎng)液透明度表示無菌生長的最低抑菌濃度（MIC值）。

1.2.4 抑菌效果的測定 用酶標(biāo)儀于450nm波長處測定細(xì)菌的OD（Optical Density）值，將96孔板用蒸餾水清洗數(shù)遍，再用1%結(jié)晶紫染色15min，用蒸餾水沖洗至透明后，加入2%的SD洗脫生物膜，再用酶標(biāo)儀于605nm波長處測試生物膜的OD值。抑菌率的計算方法如下：

1.2.5 數(shù)據(jù)處理及抑菌效果判斷標(biāo)準(zhǔn) 中草藥對細(xì)菌的最低抑菌濃度（MIC）測定國內(nèi)外尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，本文參照同類實驗的標(biāo)準(zhǔn)作為判斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，以同一板同一樣品4次重復(fù)的OD值計算抑菌率，求取平均值，并以MIC50為指標(biāo)，即抑菌率大于50%，可以認(rèn)為該樣品抑菌效果明顯。

2 結(jié)果與分析

2.1 小檗果不同極性提取物對變異鏈球菌的抑菌率

微孔板對倍稀釋法測定小檗果5種提取物對變異鏈球菌菌株生長及其生物膜形成的抑制率，結(jié)果見表1、表2。

表2 小檗果不同溶劑提取物對變異鏈球菌生物膜形成的抑制率（%，Mean±SD，n=4）Table 2 The inhibition rate of different solvent extracts from Fructus berberis on the biofilm formationof Streptococcus mutans（%，Mean±SD，n=4）

由表1、表2可知，小檗果乙酸乙酯提取物對變異鏈球菌的生長有一定的抑制作用，但效果不明顯；乙醇、水、乙酸乙酯提取物對變異鏈球菌生物膜的形成有較明顯抑制作用，正丁醇提取物濃度為1000μg/mL時，抑制率為55.5%，但對倍稀釋后，隨著濃度降低，反而促進(jìn)細(xì)菌生長。

2.2 小檗果不同極性提取物對大腸桿菌的抑菌率

微孔板對倍稀釋法測定小檗果5種提取物對大腸桿菌菌株生長及其生物膜形成的抑制率，結(jié)果見表3、表4。

由表3、表4可知，小檗果乙酸乙酯提取物濃度在250～1000μg/mL范圍內(nèi)，對大腸桿菌的生長有一定抑制作用；乙酸乙酯、氯仿、正丁醇提取物對大腸桿菌生物膜的形成有不同程度的抑制作用，其中，氯仿提取物在1000μg/mL濃度時促進(jìn)大腸桿菌生物膜形成，而濃度250μg/mL時的抑制率為57.8%。

表3 小檗果不同溶劑提取物對大腸桿菌生長的抑制率（%，Mean±SD，n=4）Table 3The inhibition rate of different solvent extracts from Fructus berberis on the growth of Escherichia coli（%，Mean±SD，n=4）

表4 小檗果不同溶劑提取物對大腸桿菌生物膜形成的抑制率（%，Mean±SD，n=4）Table 4 The inhibition rate of different solvent extracts from Fructus berberis on the biofilm formation of Escherichia coli（%，Mean±SD，n=4）

2.3 不同提取物對受試菌的MIC50

依據(jù)MIC50的判斷標(biāo)準(zhǔn)，確定小檗果正丁醇提取物抑制變異鏈球菌生物膜形成的MIC50為1000μg/mL，乙酸乙酯和乙醇提取物為500μg/mL，水提取物為250μg/mL。小檗果乙酸乙酯提取物抑制大腸桿菌的MIC50為1000μg/mL；正丁醇、乙酸乙酯、氯仿提取物抑制大腸桿菌生物膜形成的MIC50分別為1000、500、250μg/mL。

3 結(jié)論與討論

生物膜（Biofilm）是細(xì)菌的一種保護(hù)性生長模式，其被包裹在自身分泌的多聚物中形成具高度分化結(jié)構(gòu)的特殊細(xì)胞群體結(jié)構(gòu)，能不斷釋放浮游菌引起持續(xù)性感染，對抗生素和宿主免疫防御機(jī)制的抗性很強(qiáng)，80%的細(xì)菌性感染與其有關(guān)[9]，主要有由革蘭陽性球菌導(dǎo)致的齲齒，革蘭陰性厭氧性口腔細(xì)菌導(dǎo)致的牙菌斑，腸道細(xì)菌引起的膽囊感染，以及大腸桿菌和其他革蘭陰性菌引起細(xì)菌性前列腺炎等[10]。由于抗生素濫用及細(xì)菌生物膜的強(qiáng)抗性導(dǎo)致很多細(xì)菌產(chǎn)生了耐藥性，而中藥抗菌機(jī)理特殊，不易產(chǎn)生耐藥性，從天然產(chǎn)物中篩選抑菌活性成分成為研發(fā)熱點[11]。

本文經(jīng)化學(xué)鑒別預(yù)實驗檢出小檗果中含生物堿，糖和苷類，有機(jī)酸，甾體三萜，氨基酸、蛋白質(zhì)和酚類鞣質(zhì)等成分，小檗果提取物進(jìn)行抑菌篩選時，發(fā)現(xiàn)有些含藥組沒有抑菌作用反而有促進(jìn)細(xì)菌生長的的趨勢，可能其所含糖類、蛋白質(zhì)、氨基酸等成分為細(xì)菌生長提供了營養(yǎng)成分。根據(jù)實驗結(jié)果，可判斷小檗果中含有能有效抑制供試菌生長及其生物膜形成的活性成分，其不同極性提取物所含化學(xué)成分的類別和含量不同，使其抑菌活性不同，而同一提取物對不同菌種的抑制敏感性也存在差異。本方法為從小檗果的中尋找抑菌成分提供了實驗依據(jù)，對其抑菌機(jī)理及對其他細(xì)菌生長的影響還有待進(jìn)一步研究。

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Study on the antibacterial effect of extracts from Fructus berberis in vitro

TIAN Li1，2，YANG Jian3，TIAN Shu-ge2，*，WULIYA·Sayiti1，WU Ling-ling1
（1.College of Traditional Chinese Medicine，Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China；2.Xinjiang Key Laboratory of Famous Prescription and Science of Formulas，Urumqi 830011，China；3.College of Pharmacy，Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China）

TS255.1

A

1002-0306（2012）16-0148-03

2011-12-30 *通訊聯(lián)系人

田莉（1974-），女，博士，副教授，研究方向：中藥與民族藥制劑研究。

新疆維吾爾自治區(qū)高?？蒲杏媱澢嗄杲處熆蒲袉踊痦椖浚╔JEDU2009S62）。