高效液相色譜法測(cè)定番茄及其制品中番茄甙的含量

張 玉，吳慧明，王 偉，徐麗紅，王建清

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江杭州310021;2.浙江大學(xué)農(nóng)藥與環(huán)境毒理研究所，浙江杭州310029)

高效液相色譜法測(cè)定番茄及其制品中番茄甙的含量

張 玉1，吳慧明2，王 偉1，徐麗紅1，王建清1

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江杭州310021;2.浙江大學(xué)農(nóng)藥與環(huán)境毒理研究所，浙江杭州310029)

建立了固相萃取-高效液相色譜(HPLC)測(cè)定番茄及番茄制品中番茄甙的方法。樣品中的番茄甙經(jīng)過(guò)甲醇提取，PCX固相萃取法凈化，乙酰化后，采用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定。以乙腈和水(90∶10)為流動(dòng)相，經(jīng)過(guò)C18色譜柱分離，紫外檢測(cè)器檢測(cè)。結(jié)果表明:番茄甙的檢出限為 0.5mg/kg，方法回收率為90.5%～93.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為1.7%～3.2%。該方法準(zhǔn)確、靈敏、適用于番茄及番茄制品中番茄甙的測(cè)定。

番茄甙，測(cè)定，HPLC

Abstract:A method was developed for determination of tomatine in tomato and its processed products by high performance liquid chromatography(HPLC).The tomatine in sample was extracted by methanol，cleaned up with PCX solid-phase extraction cartridge，then acetylated by acetic anhydride and determined by HPLC.The mobile phase consisted of 90%acetonitrile and 10%water.The tomatine was separated on C18column and determined with UV detector at 205nm.The results showed:the detection limit of tomatine was 0.5mg/kg，the average recoveries were from 90.5%to 93.5%，and the relative standard deviations(RSDs)was from 1.7%to 3.2%.This method was accurate，sensitive and effective for determination of tomatine in tomato and its processed products.

Key words:tomatine;determination;HPLC

番茄甙又名番茄素、番茄堿，是存在于番茄葉和果實(shí)中的次生代謝產(chǎn)物，是一種含有D-木糖、D-半乳糖及兩分子葡萄糖的甾體類糖苷生物堿，具有抗菌和驅(qū)蟲的作用，其含量隨著番茄成熟而降低［1］。番茄甙高濃度下具有一定的毒性［1］，因此美國(guó)規(guī)定新選育的番茄品種必須檢測(cè)番茄甙的含量。但也有研究發(fā)現(xiàn)，一定含量的番茄甙具有降低膽固醇含量，提高免疫力，抗菌等生物活性［1-4］，鑒于其毒性及生物活性，測(cè)定番茄及其制品中番茄甙的含量就尤為重要。目前國(guó)內(nèi)外的測(cè)定方法有分光光度法［5］，高效液相色譜法(HPLC)［6-8］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［9］等。但分光光度法易受樣品中的雜質(zhì)干擾，而使測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn);氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法需將糖苷水解才能測(cè)定，不能直接定量;而高效液相色譜法相對(duì)比較簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確，但由于番茄甙的紫外吸收較低，用紫外檢測(cè)器檢測(cè)靈敏度不高，且易受雜質(zhì)干擾。因此本研究通過(guò)固相萃取純化樣品，提高番茄甙與樣品中雜質(zhì)的分離度，并用柱前衍生法改變番茄甙的紫外吸收能力，提高方法的檢測(cè)靈敏度。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇、乙腈 色譜純，德國(guó)默克;氨水 分析純，杭州高晶精細(xì)化工有限公司;乙酸酐 分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;吡啶 分析純，上海精析化工科技有限公司;番茄甙標(biāo)準(zhǔn)品(tomatine) 純度大于98%。

Dionex Ultimate-3000高效液相色譜儀 帶紫外檢測(cè)器;分析天平 Startarius，BS223s;KQ-50B超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 IKA;TDL-5-A離心機(jī) ANKE;QGC-12T氮吹儀 上海泉島;HLB固相萃取柱(200mg，3mL)Waters;PCX陽(yáng)離子交換固相萃取柱(150mg，6mL)、C18固相萃取柱(500mg，6mL)Agela。

1.2 樣品制備

將樣品用四分法取樣或直接放入組織搗碎機(jī)中搗碎混勻，制成待測(cè)樣，放入分裝容器中于-18℃保存，備用。

1.3 樣品前處理

稱取試樣5.00g，放入具塞刻度離心管中，用甲醇定容至20mL，劇烈振蕩1min后，超聲提取15min，離心，取上清液10mL，再加10mL水混勻后，上預(yù)先活化(依次用5mL甲醇和5mL水活化)的PCX陽(yáng)離子交換固相萃取柱，待樣液完全過(guò)柱，用3mL 40%的甲醇水溶液清洗柱子，最后用5mL 5%的氨化甲醇洗脫，洗脫液收集于10mL具塞試管中，在50℃下氮?dú)獯蹈伞?/p>

1.4 樣品衍生化

向試管中加0.2mL吡啶，0.4mL乙酸酐，漩渦1min，蓋上塞子，沸水浴50min，取出放入水中冷卻后，加10mL 40%的甲醇溶解，溶解液上預(yù)先活化(依次用5mL甲醇和5mL水活化)的C18固相萃取柱，待溶解液完全過(guò)柱后，用40%的甲醇5mL清洗萃取柱。而后用5mL甲醇洗脫，收集全部洗脫液，50℃下氮吹干，加1mL甲醇溶解，過(guò)0.45μm有機(jī)濾膜后待測(cè)。

1.5 液相色譜參考條件

色譜柱:waters symetry C18柱，4.6mm ×250mm(5μm);流動(dòng)相:乙腈∶水(V/V)=90∶10;流速:1.0mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):205nm;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:20μL。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

稱取一定量的番茄甙，用甲醇配制成質(zhì)量濃度為1g/L的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。吸取適量標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用甲醇稀釋成100mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間工作液。取標(biāo)準(zhǔn)中間工作液 0.0、0.025、0.050、0.100、0.25、0.50、1.00mL，氮?dú)獯蹈?。進(jìn)行衍生后，測(cè)定。即濃度為0.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0mg/L，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

對(duì)不同溶劑，即甲醇、乙醇、甲醇∶氯仿(50∶50)提取效果進(jìn)行比較。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)甲醇對(duì)番茄甙的提取效率最高(表1)，因此選取甲醇作為提取劑。

表1 不同提取溶劑對(duì)回收率的影響Table 1 Effect of different extraction solutions on recovery

2.2 試樣凈化方法選擇

由于樣品中含有較多雜質(zhì)，影響樣品的分離度，因此選取C18、HLB和PCX 3種固相萃取柱進(jìn)行前處理凈化，實(shí)驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)溶液過(guò)柱，然后對(duì)3種固相萃取柱的回收率進(jìn)行比較。表2結(jié)果表明PCX固相萃取柱的回收率最好，為96.5%。其他兩種固相萃取柱的回收率偏低分別60.5%和45.2%，不適用作為凈化方法。隨后，對(duì)經(jīng)PCX固相萃取柱凈化后的樣品進(jìn)行色譜分析，結(jié)果表明經(jīng)PCX固相萃取柱凈化后，能夠去除樣品中雜質(zhì)干擾，得到較好的凈化效果(圖3～圖4)。

表2 不同固相萃取柱對(duì)回收率的影響Table 2 Effect of different solid-phase extraction cartridges on recovery

2.3 番茄甙衍生條件選擇

番茄甙的紫外吸收較弱，直接用紫外檢測(cè)器測(cè)定，靈敏度低。由于番茄甙的糖苷上的羥基，在吡啶存在下，能與乙酸酐發(fā)生乙酰化反應(yīng)，增加雙鍵，增強(qiáng)紫外吸收，因此實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)番茄甙進(jìn)行乙?；笤贉y(cè)定。為保證衍生充分，采用乙?；Ｓ玫倪拎?乙酸酐(1∶2)作為衍生化試劑，并在前期預(yù)備實(shí)驗(yàn)中分別加入0.4、0.8、1.2mL乙酸酐進(jìn)行衍生，結(jié)果表明3種體積的乙酸酐對(duì)產(chǎn)物含量影響不大，即0.4mL乙酸酐已經(jīng)過(guò)量。因此在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中均采用0.4mL乙酸酐進(jìn)行。

為選擇最佳衍生時(shí)間，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分別衍生化20、30、40、50、60、70min 后，測(cè)定產(chǎn)物的峰面積。圖 1表明，隨著時(shí)間增長(zhǎng)，產(chǎn)物峰面積變大，但到50min時(shí)基本穩(wěn)定，而后略有下降，因此選取50min作為最佳衍生時(shí)間。

圖1 乙?；瘯r(shí)間對(duì)產(chǎn)物峰面積的影響Fig.1 Effect of derivation time on the chromatogram peak area of production

2.4 紫外吸收波長(zhǎng)的確立

通過(guò)對(duì)溶解于甲醇中的番茄甙衍生物紫外吸收掃描，發(fā)現(xiàn)在205nm處有最大吸收。因此選擇檢測(cè)波長(zhǎng)在205nm處，可確保方法的檢測(cè)靈敏度。并通過(guò)DAD進(jìn)行光譜輔助定性(圖2)。

圖2 番茄甙衍生物的光譜圖Fig.2 The spectrogram of tomatine derivation product

2.5 儀器條件的選擇

選擇乙腈和水作為流動(dòng)相進(jìn)行樣品測(cè)定。結(jié)果表明樣品在乙腈∶水(90∶10)的情況下，番茄甙衍生物與其他雜質(zhì)能夠得到很好的分離(圖3～圖4)。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.3 Chromatogram of tomatine standard

圖4 番茄樣品色譜圖Fig.4 Chromatogram of tomato sample

2.6 線性范圍與檢出限

在0～100mg/L之間，紫外吸收峰面積與番茄甙的濃度具有較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.9999(圖5)。以3倍信噪比的方法得出，本方法檢出限為0.5mg/kg。

圖5 番茄甙標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.5 Standard curve of tomatine

2.7 準(zhǔn)確度和精密度

以添加回收率表示方法的準(zhǔn)確度，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)表示方法的精密度。在不同樣品中加入不同水平已知量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，同時(shí)測(cè)定樣品和加標(biāo)樣品，計(jì)算回收率。從表3結(jié)果分析，不同添加水平的樣品回收率在90.5%～93.5%之間，方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差在1.7%～3.2%之間。滿足樣品檢測(cè)的要求。

表3 方法回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(%)Table 3 The recoveries and relative standard deviations of the method

2.8 樣品測(cè)定結(jié)果

采用本實(shí)驗(yàn)所建立的方法對(duì)不同番茄及番茄制品進(jìn)行測(cè)定，該方法適用于番茄及其制品的測(cè)定。對(duì)不同成熟度的番茄測(cè)定結(jié)果表明，隨著番茄成熟度增加，番茄甙含量減少;番茄醬樣品則未檢出番茄甙(表4)。

表4 番茄及番茄醬中番茄甙的含量Table 4 The contents of tomatine in different tomatos and tomato jam

3 結(jié)論

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立了固相萃取-柱前衍生-高效液相色譜法測(cè)定番茄及番茄制品中番茄甙的測(cè)定方法。該方法的回收率為90.5%～93.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為1.7%～3.2%，檢出限為0.5mg/kg。該方法具有儀器要求不高，準(zhǔn)確度和靈敏度高的特點(diǎn)，適用于番茄及番茄制品中番茄甙的測(cè)定。

［1］Friedman M.Tomato glycoallkaloids role in the plant and in the diet［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50:5751-5780.

［2］Rananthanan P，Attard GS，Sheikh NA，et al.Novel aggregate structure adjuvants modulate lymphocyte proliferation and Thl and Th2 cytokine profiles in ovalbumin immunized mice［J］.Vaccine，1999，18:140-152.

［3］Friedman M，F(xiàn)itch T E，Yokoyama WH.Lowering of plasma LDL cholesterol in hamsters by the tomato glycoalkaloid tomatine［J］.Food and Chemical Toxicology，2000，38:549-553.

［4］Heal KG，Sheikh NA，Hollingdale MR，et al.Potentiation by a novel alkaloid glycoside adjuvant of a protective cytotoxic T cell immune response specific for a preerythrocytic malaria vaccine candidate antigen［J］.Vaccine，2001，19:4153-4161.

［5］Dao L，F(xiàn)riedman M.Chlorophyll chlorogenic acid glycoalkaloid and protease inhibitor content of fresh and green potatoes［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1994，42:633-639.

［6］陶永霞，段繼華.番茄堿的高效液相色譜分析［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊，2007(6):84-85.

［7］Bushway R，Perkins LB，Patadis LR，et al.High-performance liquid chromatographic determination of tomato glycoalkaloid，tomatine in green and red tomatoes ［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1994，42:2824-2829.

［8］ Friedman M，Levin CE，McDonald GM.Tomatine determination in tomatoes by HPLC using pulsed amperometric detection［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1994，42:1959-1964.

［9］Laurila J，Laakso I.Determination of solanidine and tomatidine-type glycoalkaloid aglycons by gas chromatography mass spectrometry［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1999，47:2738-2742.

Determination of tomatine in tomato and its processed products by high performance liquid chromatography

ZHANG Yu1，WU Hui-ming2，WANG Wei1，XU Li-hong1，WANG Jian-qing1
(1.Institute of Quality and Standard for Agriculture Product，Zhejiang Academy of Agriculture Science，Hangzhou 310021，China;2.Institute of Pesticide and Environmental Toxicology，Zhejiang University，Hangzhou 310029，China)

TS255.1

A

1002-0306(2012)15-0322-03

2011-12-15

張玉(1977-)，女，博士，副研究員，研究方向:食品安全檢測(cè)。

浙江省科技廳重大科技專項(xiàng)(2009C12052)。