獨(dú)腳當(dāng)歸阿魏酸和多糖含量的測定

任曉云，尹春英，陳建中，陳曉珍，李 娜

中國科學(xué)院成都生物研究所，成都 610041

獨(dú)腳當(dāng)歸是傘形科屬植物西藏凹乳芹(Vicatia thibetica de Boiss)的根，也叫野當(dāng)歸，產(chǎn)于四川、云南及西藏，生于海拔2700～4000 m的山坡、草地、林下、河灘及灌叢內(nèi)［1］。其味辛、甘、微苦，性溫。具有祛風(fēng)除濕、散寒止痛等功效，主要用于風(fēng)寒濕痹、中寒胃痛、腰部冷痛等癥［2］。

四川省阿壩州馬爾康一帶有以獨(dú)腳當(dāng)歸充當(dāng)當(dāng)歸使用［1］。當(dāng)歸是傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥根，主產(chǎn)我國甘肅省岷山山區(qū)，具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便等功效［3］，其主要成份是阿魏酸、揮發(fā)油、多糖以及微量元素等［4］，其中阿魏酸和多糖常作為當(dāng)歸藥材質(zhì)量控制的指標(biāo)成分［5］。阿魏酸具有抗血小板凝集和血栓;清除亞硝酸鹽、氧自由基、過氧化亞硝基;抗菌消炎、抗腫瘤、抗突變、增加免疫功能;增強(qiáng)人體精子活力和運(yùn)動性等功能［6］。多糖是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一，多糖在增強(qiáng)免疫力、降血糖、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗衰老、抗凝血等方面發(fā)揮著生物活性作用［7］。

目前為止，對四川阿壩州一帶所產(chǎn)獨(dú)腳當(dāng)歸的阿魏酸以及多糖含量的測定尚未見報道，更無從比較其與當(dāng)歸的有效成份含量。本實(shí)驗(yàn)以阿壩州紅原縣所產(chǎn)的兩年生獨(dú)腳當(dāng)歸為材料，探索其主要成份阿魏酸和多糖含量的測定方法，比較了與當(dāng)歸的藥效差異，為進(jìn)一步建立獨(dú)腳當(dāng)歸藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

儀器:Aglient 1200高效液相色譜儀(美國安捷倫科技公司);UV-2000紫外可見分光光度計(上海奧譜勒儀器有限公司);離心機(jī)(美國賽默飛世爾科技公司);電子分析天平(瑞士METTLER公司)等。

試劑:葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(成都曼思特生物科技有限公司，批號MUST-11020603);阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品(成都曼思特生物科技有限公司，批號 MUST-11112204);濃硫酸(西隴化工有限公司);苯酚(重蒸餾，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司);甲醇為色譜純，其它試劑均為分析純。

材料:四川紅原產(chǎn)兩年生獨(dú)腳當(dāng)歸藥材。

1.2 方法

1.2.1 獨(dú)腳當(dāng)歸阿魏酸含量測定

紫外光譜掃描檢測確定HPLC檢測波長:將獨(dú)腳當(dāng)歸用70%甲醇回流提取后，經(jīng)稀釋到適當(dāng)?shù)臐舛?，在紫?分光光度計200～400 nm的波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，檢測其最大吸收波長為239.0 nm和320.0 nm，結(jié)合參考文獻(xiàn)［8］和紫外掃描結(jié)果確定選擇320 nm作為檢測波長。

采用液相色譜條件:色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)柱，流動相為0.5%冰醋酸(A)和甲醇(B)，梯度洗脫程序?yàn)?0～30 min(30%B ～50%B)，30～32 min(50%B ～95%B)，32～40 min(95%B～30%B);測定波長:320 nm;柱溫:35 ℃;流速:0.8 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:精密稱取阿魏酸10.20 mg于100 mL容量瓶中，用70%甲醇溶解并定容至100 mL，得到 0.102 mg/mL儲備液。分別精密吸取0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mL 分別置于 10 mL 容量瓶中，用70%甲醇溶解并定容至10 mL，進(jìn)樣前用0.45 μm 濾膜過濾，10 μL 進(jìn)樣，測定阿魏酸峰面積，用峰面積積分值與對照品質(zhì)量濃度進(jìn)行線性擬合，得到阿魏酸線性回歸方程。標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC譜圖見圖1，保留時間為15.928 min。

圖1 阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品HPLC譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of the ferulic acidstandard

樣品供試液制備:取獨(dú)腳當(dāng)歸粉末(過60目篩)約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，密塞，稱定重量，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量。用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，0.45 μm 濾膜濾過，供阿魏酸測定。

方法學(xué)考察:對阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品的精密度以及供試液中阿魏酸的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、回收率進(jìn)行考察。

樣品測定:精密稱取獨(dú)腳當(dāng)歸粉1.0 g，平行制備供試液5份，在與標(biāo)準(zhǔn)品相同的HPLC條件下，進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖，測定色譜峰的峰面積，按外表法計算樣品中阿魏酸的平均含量。樣品的HPLC譜圖見圖2，保留時間為15.904 min。

圖2 獨(dú)腳當(dāng)歸70%甲醇提取物的HPLC譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of 70%methanol extract of V.thibetica

1.2.2 獨(dú)腳當(dāng)歸多糖含量測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:精密稱取葡萄糖對照品5.40 mg，于50 mL容量瓶中，以蒸餾水溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度為108 μg/mL的葡萄糖對照品溶液。精密量取 0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL，分別置于干燥、具塞試管中，加蒸餾水至1.0 mL，再加入5%苯酚溶液2.0 mL，混勻，加濃硫酸 7.0 mL，充分混勻，置沸水浴加熱20 min，取出，放置至室溫。另取1.0 mL蒸餾水平行操作，作空白對照。于最大吸收波長490 nm處測定其吸光度，用吸光度與葡萄糖對照品的質(zhì)量濃度進(jìn)行線性擬合，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品供試液制備［8］:取獨(dú)腳當(dāng)歸樣品粉末(過40目篩)約2.0 g，精密稱定，加80%乙醇100 mL回流1 h，濾過，濾渣加水100 mL回流2 h，趁熱抽濾，濾液適當(dāng)濃縮，用80%乙醇沉淀，靜置過夜，離心，棄上清液，沉淀用溫水溶解，轉(zhuǎn)移并定容至100 mL容量瓶中，再精密量取上述溶液1.0 mL，轉(zhuǎn)移并定容至10 mL量瓶中，供多糖測定［8］。

方法學(xué)考察:對葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的精密度以及供試液中多糖的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、回收率進(jìn)行考察。

樣品測定:精密稱取獨(dú)腳當(dāng)歸2.0 g，平行制備供試液5份，顯色并測定吸光度，按外標(biāo)法計算樣品中多糖的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿魏酸和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的線性范圍

以HPLC記錄的峰面積(Y)對阿魏酸的質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行直線回歸，回歸方程為 Y=58.2255X-5.0100，相關(guān)系數(shù) r=0.9998，表明當(dāng)阿魏酸在 1.02～10.20 μg/mL與峰面積呈良好的線性關(guān)系;以吸光度(Y)對葡糖糖的質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行直線回歸，回歸方程為 Y=0.0075X-0.0548，相關(guān)系數(shù)為 r=0.9998，表明當(dāng)葡萄糖在 21.6 ～86.4 μg/mL 與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.2 阿魏酸和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的精密度考察

精密吸取10.20 μg/mL的阿魏酸對照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，計算色譜圖中阿魏酸的相對保留時間的RSD為0.43%，并計算阿魏酸的峰面積的RSD為0.40%，均小于2.0%，表明進(jìn)樣精密度良好;另精密量取葡萄糖對照品溶液0.5 mL，加水至1.0 mL，顯色后分別測定吸光度，重復(fù)測定5次，計算RSD為0.21%。

2.3 供試液中阿魏酸和多糖的重現(xiàn)性考察

精密稱取獨(dú)腳當(dāng)歸1.0 g，平行制備供試液5份，進(jìn)樣10 μL，記錄各色譜圖，測定其峰面積，供試液中阿魏酸的重現(xiàn)RSD為1.62%;另精密稱取獨(dú)腳當(dāng)歸2.0 g，平行制備供試液5份，精密量取供試品溶液1.0 mL，依法測定吸光度，并計算樣品多糖含量的重現(xiàn)RSD為1.33%。

2.4 供試液中阿魏酸和多糖的穩(wěn)定性考察

精密稱取獨(dú)腳當(dāng)歸1.0 g制備供試液，分別于0、2、4、6、8、10、12 h 進(jìn)樣 10μL。記錄各色譜圖，測定其峰面積，對照品在不同時間點(diǎn)峰面積的RSD為0.92%，結(jié)果表明供試品溶液中阿魏酸在12 h內(nèi)穩(wěn)定;另精密稱取獨(dú)腳當(dāng)歸2.0 g，制備供試液，精密量取供試品溶液 1.0 mL，于顯色后 0、10、20、30、40、60 min，測定吸光度，多糖RSD為0.16%，結(jié)果表明供試液在顯色后1 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 供試液中阿魏酸和多糖的回收率考察

精密稱取獨(dú)腳當(dāng)歸樣品0.5 g共5份，分別加入0.102 mg/mL阿魏酸對照品溶液0.4 mL，待溶劑揮干后，按樣品測定方法提取并測定。取5次測定的平均值計算回收率99.56%(n=5)，阿魏酸回收率的RSD為1.57%，回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1;另精密稱取獨(dú)腳當(dāng)歸樣品1.0 g，平行制備供試液5份，在提取液中加入一定量的葡萄糖對照液，測定吸光度，取5次測定的平均值計算回收率為100.39%(n=5)，供試液中多糖回收率的RSD為1.24%，回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 標(biāo)準(zhǔn)品阿魏酸的回收率Table 1 Recovery rate of ferulic acid

表2 標(biāo)準(zhǔn)品葡萄糖的回收率Table 2 Recovery rate of glucose

2.6 獨(dú)腳當(dāng)歸中阿魏酸和多糖的含量分析

按照藥典中阿魏酸的提取方法，用70%甲醇回流提取獨(dú)腳當(dāng)歸中的阿魏酸，利用高效液相色譜法測定了獨(dú)腳當(dāng)歸中阿魏酸的含量為86.10 μg/g。采用水提醇沉的方法提取獨(dú)腳當(dāng)歸中所含多糖，并通過苯酚-硫酸法測定了多糖的含量為34.60mg/g。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法測定了獨(dú)腳當(dāng)歸中阿魏酸的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法具有操作簡便、靈敏、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，可以用于獨(dú)角當(dāng)歸藥材中阿魏酸的含量檢測和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的控制。但是與已報道的當(dāng)歸阿魏酸含量相比［8］，獨(dú)腳當(dāng)歸阿魏酸含量偏低。阿魏酸作為當(dāng)歸藥材質(zhì)量控制的指標(biāo)成分之一，如果將獨(dú)腳當(dāng)歸充當(dāng)當(dāng)歸使用，其藥效會明顯弱于當(dāng)歸。

本實(shí)驗(yàn)利用多糖不溶于乙醇的性質(zhì)，于80%乙醇中回流提取獨(dú)腳當(dāng)歸，以除去脂溶性雜質(zhì)，然后利用多糖溶于熱水的性質(zhì)，在熱水中回流提取多糖，并通過改變水提液極性用乙醇沉淀出多糖，最終得到粗多糖。利用具有顯色穩(wěn)定，準(zhǔn)確可靠，重現(xiàn)性好，回收率高等優(yōu)點(diǎn)的苯酚-硫酸法［9］，測定了獨(dú)角當(dāng)歸中多糖的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確度較高，可以用于獨(dú)腳當(dāng)歸藥材多糖含量檢測和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的控制。該實(shí)驗(yàn)同時說明了獨(dú)腳當(dāng)歸中含有較豐富的多糖，為獨(dú)腳當(dāng)歸進(jìn)一步開發(fā)及其多糖生物學(xué)活性研究奠定了基礎(chǔ)。

1 Editorial Committee for Flora of the Chinese Academy of Sci-ences(中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會).Flora of China(中國植物 志).Beijing:China Science Press，1979.Vol55，185.

2 State administration of traditional Chinese medicine of the People's Republic of China(國家中醫(yī)藥管理局).Zhonghua Bencao(中華本草).Shanghai:Shanghai Science and Technology Press，1999，15:1037-1038.

3 Chinese Pharmacopoeia Commission(國家藥典委員會).Pharmacopoeia of the People’s Republic of China(中華人民共和國藥典).Beijing:China Medical Science Press，2005，1:89.

4 Chen F(陳飛)，Yao C(姚成).Advances in study on the components inAngelica sinensis.Res Tradit Chin Med(中醫(yī)藥研究)，2002，18:51-54.

5 Zhao KJ(趙奎君)，Zhong M(鐘萌)，Xie JD(謝俊大).Contents comparison of ferulic acid，ligustilide and total polysaccharide in radix Angelicae sinensis from different regions.Chin J Inform Tradit Chin Med(中國中醫(yī)藥信息雜志)，2007，14(12):37-38.

6 Hu YY(胡益勇)，Xu XY(徐曉玉).Research on chemical constituents of ferulic acid and its pharmacological effects.Chin Tradi Pat Med(中成藥)，2006，28:253-255.

7 Jiang MH(姜曼花)，Qiu XM(邱細(xì)敏)，Liu SZ(劉勝姿)，et al.The extraction，purification and determination of polysaccharide inGynuradivaricata(L.)DC.Shizhen Med Mat Med Res(時珍國醫(yī)國藥)，2008，19:7412-7414.

8 Yan H(嚴(yán)輝)，Duan JA(段金廒)，Qian DW(錢大瑋)，et al.Evaluation and analysis of the quality of Angelica sinensis from different source in China.Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，2009，40:1988-1992.

9 Zhong FX(鐘方曉).Ren HH(任海華)，Li Y(李巖).Comparison of methods in determination of polysaccharide content.Shizhen Med Mat Med Res(時珍國醫(yī)國藥)，2007，18:1916-1917.