響應(yīng)面法優(yōu)化唐古特白刺種子總黃酮超聲提取工藝

胡 娜，楊仁明，何彥峰，王洪倫，王小艷，索有瑞*

1中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所，西寧 810001;2中國(guó)科學(xué)院研究生院，北京 100049

白刺(Nitraria)是蒺藜科(ZygophyUceae)的旱生或超旱生典型荒漠植物［1］，是西部蒙、藏、維等少數(shù)民族的傳統(tǒng)藥材，其果實(shí)具有較高的藥用價(jià)值，可治療胃病，有助于消化，還可治傷風(fēng)感冒、頭痛頭暈［2］，具有降血糖、降血脂、抗氧化等作用［3］。研究表明，其藥理活性與其果實(shí)中豐富的黃酮類、花色苷、總糖、維生素E及必需氨基酸等活性成分有關(guān)［5-7］。其中白刺總黃酮具有降低血清、肝組織中的MDA，增強(qiáng)其SOD、GSH-PX的活力，延緩衰老的作用［8］。

目前白刺種子中黃酮類化合物的提取方法主要有加熱回流提取和索式提取，具有提取時(shí)間長(zhǎng)、有機(jī)溶劑消耗量大、提取效率低等缺點(diǎn)。超聲波提取是利用超聲波在液體中產(chǎn)生“空穴作用”，破壞植物細(xì)胞和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，從而增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)容物通過(guò)細(xì)胞膜的穿透能力，有利于黃酮類化合物的釋放與溶出［9］。

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選擇乙醇濃度、超聲時(shí)間、超聲溫度3個(gè)主要因素，以總黃酮提取得率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法對(duì)唐古特白刺種子中總黃酮超聲輔助提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。以期為研究唐古特白刺種子總黃酮的超聲提取路線提供參考，為唐古特白刺的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮白刺果實(shí)采摘于柴達(dá)木盆地，由中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所盧雪峰博士鑒定為唐古特白刺(Nitraria tangutorum Bobr.)的果實(shí);蘆丁，購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司(批號(hào):MUST-11040302);石油醚、乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DFY1000C高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，溫嶺市林大機(jī)械有限公司;UV-759型紫外-可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司;KQ-250DB型超聲波清洗器，昆山市超聲波儀器有限公司;101-1ES型電熱鼓風(fēng)干燥箱，北京市永光明醫(yī)療儀器廠;優(yōu)普UPT系列超純水器，成都超純科技有限公司;ALC-110.4型電子天平，德國(guó)Acculab公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品溶液的制備

將榨完果汁剩下的果渣進(jìn)行清洗，去除果皮，保留種子，并將洗干凈的白刺種子于60℃烘箱中烘至恒重。取200 g干燥好的白刺種子，用高速萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎，過(guò)32目篩，備用。

白刺種子除油脂:取100 g過(guò)篩后的白刺種子粉末，用石油醚索氏提取3次，每次2 h，待石油醚揮發(fā)完全后置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中45℃條件下烘干，備用。

精確稱取除脂后的白刺種子2.0 g置于100 mL圓底燒瓶中，按照一定的液料比、乙醇濃度、超聲時(shí)間和超聲溫度進(jìn)行超聲提取，提取完成后過(guò)濾并用60%乙醇定容至50 mL容量瓶中，即為樣品溶液。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg，加入60%的乙醇溶液，定容至50 mL的容量瓶中，搖勻，配制成0.1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別取溶液 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于10 mL 的容量瓶中，加30%乙醇至5 mL，再加入0.3 mL 5%的 NaNO2溶液，搖勻放置6 min后再加入0.4 mL 10%的Al(NO3)3溶液，搖勻放置6 min，最后加入4 mL 4%NaOH溶液，加水至刻度，搖勻放置15 min，在510 nm處測(cè)定其吸光值，以蘆丁濃度C(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)作回歸曲線，得回歸方程為 A=12.792C-0.0035(R2=0.9990)。

1.3.3 總黃酮提取得率的計(jì)算

將測(cè)得的吸光度值代入回歸方程計(jì)算總黃酮含量，即可求出樣品溶液中總黃酮含量C，再代入下式計(jì)算白刺種子總黃酮提取得率。

式中:V為定容體積(mL)，M為稱取的白刺種子的質(zhì)量(g)，C為樣品溶液中總黃酮的含量(mg/mL).

1.4 提取條件的優(yōu)化設(shè)計(jì)

根據(jù)前期試驗(yàn)篩選，本試驗(yàn)主要研究乙醇濃度、超聲時(shí)間、超聲溫度三個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值的影響，首先進(jìn)行單因素試驗(yàn)。單因素試驗(yàn)只考察多個(gè)因素單獨(dú)對(duì)響應(yīng)值的影響，不能反映出多個(gè)因素之間相互作用的影響。通過(guò)單因素預(yù)試驗(yàn)，應(yīng)用 Design-Expert8.0軟件，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，利用響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，確定唐古特白刺種子總黃酮超聲提取的最佳提取條件。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平表Table 1 Levels and code of response surface experiments

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 液料比對(duì)總黃酮提取得率的影響

圖1 不同液料比對(duì)白刺種子總黃酮提取得率的影響Fig.1 Effects of ratio of material to water on extraction ratio of the total flavonoids in Nitraria tangutorum Bobr.

固定其它條件不變(乙醇濃度75%，時(shí)間60 min，溫度40 ℃)考察液料比(5、10、15、20、25 mL/g)對(duì)白刺種子總黃酮提取得率的影響。結(jié)果如圖1所示，在5～15 mL/g液料比范圍內(nèi)，總黃酮提取得率隨液料比的增加而呈上升趨勢(shì)，這是因?yàn)槿軇┯昧吭酱髮?duì)成分的溶解能力越強(qiáng)，黃酮類化合物在大劑量的溶劑中始終成“稀溶液”狀態(tài)，利于擴(kuò)散的進(jìn)行。在液料比為15 mL/g時(shí)，總黃酮提取得率達(dá)到最大，說(shuō)明一定比例的溶劑已將有效成分基本溶出完全。因此，從成本和能耗方面考慮，液料比選擇在15 mL/g為宜。

2.1.2 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取得率的影響

圖2 乙醇濃度對(duì)白刺種子總黃酮提取得率的影響Fig.2 Effects of ethanol concentration on extraction ratio of the total flavonoids in Nitraria tangutorum Bobr.

固定其它條件不變(液料比15 mL/g，溫度40℃，時(shí)間60 min)，考察乙醇濃度(45%、55%、65%、75%、85%)對(duì)白刺總黃酮提取得率的影響。結(jié)果如圖2所示，在乙醇濃度為45% ～65%的范圍內(nèi)，總黃酮提取得率隨著乙醇濃度的增加而增加。但當(dāng)乙醇濃度大于65%時(shí)，總黃酮提取得率隨著乙醇濃度的增加而減小。因而，結(jié)合得率和成本考慮，應(yīng)選擇濃度為65%的乙醇提取白刺種子總黃酮。

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取得率的影響

圖3 不同超聲時(shí)間對(duì)白刺種子總黃酮提取得率的影響Fig.3 Effects of extraction time on extraction ratio of the total flavonoids in Nitraria tangutorum Bobr.

固定其它條件不變(液料比15 mL/g，乙醇濃度75%，溫度 60 ℃)，考察超聲時(shí)間(20、40、60、80、100 min)對(duì)白刺種子總黃酮提取得率的影響。結(jié)果如圖3所示，總黃酮提取得率隨時(shí)間的增長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，60 min附近達(dá)到最大，之后趨于平緩，說(shuō)明提取液內(nèi)有效成分濃度已達(dá)到平衡。為減少能耗，節(jié)約時(shí)間，超聲時(shí)間選擇60 min左右為宜。

2.1.4 超聲溫度對(duì)總黃酮提取得率的影響

圖4 不同超聲溫度對(duì)白刺種子總黃酮提取得率的影響Fig.4 Effects of extraction temperature on extraction ratio of the total flavonoids in Nitraria tangutorum Bobr.

固定其它條件不變(液料比15 mL/g，乙醇濃度75%，時(shí)間60 min)，考察超聲溫度 20、30、40、50、60℃對(duì)白刺種子總黃酮提取得率的影響。結(jié)果如圖4所示，在40℃之前，隨著溫度的升高，總黃酮提取得率逐漸增加，且增幅明顯，40℃時(shí)達(dá)到最大，之后略顯下降。這一趨勢(shì)可能是由于溫度過(guò)高，總黃酮類物質(zhì)分解，使其得率下降，且在工業(yè)生產(chǎn)中，過(guò)高的超聲溫度耗能較大而不易操作，因此選擇溫度為40℃左右為宜。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化白刺種子總黃酮工藝

2.2.1 響應(yīng)面分析方案與結(jié)果

通過(guò)上述的單因素分析，我們篩選出了乙醇濃度、超聲時(shí)間、超聲溫度三個(gè)主要因素，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)結(jié)合響應(yīng)面法，以總黃酮提取得率為響應(yīng)值，對(duì)影響超聲提取白刺種子總黃酮的工藝進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Optimization of extraction conditions and results of experimental design

采用Design-Expert8.0軟件對(duì)各因素進(jìn)行回歸擬合，得回歸方程:總黃酮提取得率 =1.17+0.03X1+0.065X2+0.048X3+0.02X1X2+0.01X1X3+0.025X2X3-0.16-0.079-0.13

表3 方差分析結(jié)果Table 3 ANOVA of regression analysis

表3中的回歸模型方差分析的結(jié)果表明:X1、X2、X3、X1X1、X2X2、X3X3(P ＜ 0.01)為極顯著項(xiàng);X1X2、X2X3(P ＜0.05)為顯著項(xiàng);X1X3項(xiàng)不顯著。R2=0.9936表明該二次回歸得到的白刺種子總黃酮提取得率模型與實(shí)際擬合較好，符合度為99.36%，說(shuō)明使用該方程模擬實(shí)際的三因素三水平分析是可行的。同時(shí)，由 F值的大小可以推斷，在所選擇的試驗(yàn)范圍內(nèi)，3個(gè)因素對(duì)總黃酮提取得率影響的順序?yàn)槌晻r(shí)間(X2)＞超聲溫度(X3)＞乙醇濃度(X1)。

圖7 Y=f(X2，X3)的響應(yīng)面與等高線Fig.7 Responsive surfaces and contours of Y=f(X2，X3)

2.2.2 因素間的交互影響

根據(jù)擬合模型繪制總黃酮提取得率響應(yīng)面的三維圖與等高線，可直觀地看出響應(yīng)面的最高點(diǎn)，即參數(shù)范圍內(nèi)的極值以及因素間的相互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，依次可以確定最佳工藝參數(shù)范圍。Design-Expert8.0軟件處理后三維響應(yīng)面和等高線圖見圖5～7。

分析3組圖可知，超聲時(shí)間、超聲溫度對(duì)總黃酮提取得率的影響較為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡，即隨著超聲時(shí)間、超聲溫度的增加或減少，響應(yīng)值變化較大;乙醇濃度對(duì)總黃酮提取得率的影響不大，表現(xiàn)為曲線較為平滑，即隨乙醇濃度增加或減少，響應(yīng)值變化較小。圖5和圖7的等高線圖呈明顯的橢圓形，說(shuō)明超聲時(shí)間和乙醇濃度的交互作用以及超聲時(shí)間和超聲溫度的交互作用顯著。圖6的等高線圖不呈橢圓形，說(shuō)明乙醇濃度和超聲溫度的交互作用不顯著。

2.2.3 白刺種子總黃酮提取工藝條件的確定

通過(guò)軟件Design-Expert 8.0求解方程，得出了最優(yōu)提取工藝條件為:乙醇濃度為65.7%，超聲時(shí)間為67.6 min，超聲溫度為41.7℃，在此工藝條件下白刺種子總黃酮得率可達(dá)1.21%。

2.2.4 工藝驗(yàn)證

綜合考慮時(shí)間、成本等因素，對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行了一定的修正，確定適宜的提取工藝條件為:乙醇濃度為66%，超聲時(shí)間為68 min，超聲溫度為42℃。在此條件下，進(jìn)行了3次重復(fù)試驗(yàn)，白刺種子平均總黃酮提取得率為1.20%，與預(yù)測(cè)值基本吻合。

3 結(jié)論

通過(guò)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)得到超聲提取白刺種子總黃酮的優(yōu)化工藝條件:乙醇濃度為66%，超聲時(shí)間為68 min，超聲溫度為42℃，總黃酮提取得率為1.20%。結(jié)果表明，采用響應(yīng)面法優(yōu)化白刺種子總黃酮的提取工藝條件具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，為唐古特白刺的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

1 Li BH(李必華)，Xing SJ(邢尚軍).The Nitraria and its Exploitation and Utilization.Shandong For Sci and Tech(山東林業(yè)科技)，1994，(3):7-12.

2 Wang YG(王彥閣)，Yang XH(楊曉暉)，Yu CT(于春堂)，et al.The actuality，ecological function and protective measures of Genus Nitraria.Res Soil and Water Conserv(水土保持研究)，2007，6(14):75-79.

3 Liu YM(劉勇民).Pharmacopoeia of Uighur Medicine.Xinjiang:Xinjiang Publishing House of Science，Technology and Medicine，1999.185.

4 Northwest Institute of Plateau Biology，Chinese Academy of Sciences(中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所).Flora of Qinghai.Xining:Qinghai people's Publishing House(青海人民出版社)，1999.288-290.

5 Wang FZ(王福珍).Sand plants of Nitraria exploitation prospects.Food and Nut in Chin(中國(guó)食品與營(yíng)養(yǎng))，1997:19-41.

6 Suo YR(索有瑞)，Wang HL(王洪倫)，Wang HQ(汪漢卿).Research on Decreasing blood lipid and anti-oxidative effect of fruit of Nitraria tangutorum Bobr.from Tsaidam Basin.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2004，16:54-58.

7 Suo YR(索有瑞)，Wang HQ(汪漢卿).Studies on hypoglycemic effect of fruit of Nitraria Tangutorum Bobr.from Qinghai Tsaidam Basin.Food Sci(食品科學(xué))，2004，25:164-l67.

8 Fan LL(樊蓮蓮).Study the extraction，purification，separation of flavonids and anti-oxidative effect on effective fractions from Nitraria.Shihezi univ，2007.

9 Wang L，Weller CL.Recent advances in extraction of nutraceutica1s from plants.Food Sci＆ Tech，2006，17:300-312.

10 Jiang XG(姜顯光)，Hou DY(侯冬巖)，Hui RH(回瑞華)，et al.Extraction of total flavonoids from Kalimeris indica Leaves.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2011，23:967-969.