馬尾松花粉中植物甾醇成分分析

孫陽恩，鈐莉妍，張 含，楊長軍，王 桐，石麗花，耿 越*

1山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南 250014;2煙臺新時代健康產(chǎn)業(yè)有限公司，煙臺 264006

松花粉藥名松黃，是松科植物馬尾松、油松或同屬種植物的干燥花粉，是傳統(tǒng)的食藥兼用的花粉品種，具有抗衰老、調(diào)節(jié)免疫功能、抗疲勞、降血糖、美容、減肥等多種藥理作用［1］。植物甾醇作為一種天然成分因為其具有降低人體血清膽固醇從而預(yù)防心腦血管疾病的作用，而受到廣泛的關(guān)注［2，3］。在歐洲早已有相關(guān)的產(chǎn)品暢銷，例如知名的Bencol?［4］。國內(nèi)在2010年植物甾醇獲得新資源食品批準(zhǔn)之后(中華人民共和國衛(wèi)生部.關(guān)于批準(zhǔn)DHA藻油、棉籽低聚糖等7種物品為新資源食品及其他相關(guān)規(guī)定的公告.2010年第3號)，也有植物甾醇玉米油等產(chǎn)品上市，市場潛力巨大，開發(fā)前景廣闊。但關(guān)于花粉中植物甾醇的報道為數(shù)不多［5-8］，馬尾松花粉中植物甾醇的種類目前尚未有詳細(xì)報道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

膽固醇(純度99%)(美國Sigma公司);Sylon BFT(BSTFA+TMCS，99∶1)(美國 Sigma 公司);吡啶(色譜純)(天津科密歐公司);正己烷、醋酐、濃硫酸、冰醋酸(分析純)(國藥集團(tuán))。

1.2 儀器與設(shè)備

6890-5973氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司);TU-1810 PC紫外可見分光光度計(北京普析通用公司);5804R臺式高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 松花粉中粗甾醇的提取

稱取10 g破壁馬尾松花粉，加150 mL正己烷超聲浸提30 min，離心。上清液40℃旋蒸濃縮至剩余2 mL左右，氮氣吹干，得蒸發(fā)殘渣。加50 mL無水乙醇，10 mL KOH溶液(500 g/L)，沸水浴冷凝回流30 min。反應(yīng)完之后，立即流水冷卻至室溫。將樣品轉(zhuǎn)移至500 mL分液漏斗中，用20 mL去離子水沖洗錐形瓶，洗液并入分液漏斗，然后分別用100、100和60 mL石油醚萃取3次，合并3次有機(jī)相。用蒸餾水洗至中性。萃取液經(jīng)無水硫酸鈉脫水，旋蒸濃縮至2 mL，氮氣吹干，得不皂化物。冰醋酸溶解定容至10 mL。

1.3.2 顯色液配制

將醋酐和濃硫酸預(yù)先在冰箱中冷藏，取干燥的燒杯，置于冰水浴中。加入60 mL醋酐，30 mL冰醋酸，10 mL濃硫酸，混合均勻。然后加入2 mg無水硫酸鈉，4 ℃保存?zhèn)溆茫?］。

1.3.3 L-B比色法測定波長的選擇

取5 mL顯色液于干燥潔凈的試管中，加入200 μL樣品溶液，于23℃水浴中顯色后在190～900 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.3.4 L-B比色法反應(yīng)時間的選擇

取5 mL顯色液加入潔凈干燥的試管中，加200 μL樣品溶液，振蕩混勻，轉(zhuǎn)移至比色皿中，在室溫(23℃)下進(jìn)行時間-吸光值曲線掃描。

1.3.5 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線制作

準(zhǔn)確稱取膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品，通過逐級稀釋的方法配成標(biāo)準(zhǔn)系列液。溶劑為冰醋酸，濃度分別為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL，分別測定吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6 GC-MS定性分析

植物甾醇衍生化:取10 mg干燥的不皂化物于玻璃反應(yīng)瓶中，加入200 μL 吡啶和Sylon BFT(1∶1)，溶解樣品，振蕩混勻，封口后置于70℃水浴中反應(yīng)30 min。

色譜柱:Agilent HP-5石英毛細(xì)管柱(30 m ×0.25 mm，0.5 μm);升溫程序:200 ℃保持 5 min，以2℃/min升至230℃，保持10 min，再以1℃/min升至240℃，保持10 min，2℃/min升至250℃，保持20 min，2℃/min升至300℃，保持15 min;載氣為氦氣，流速1.0 mL/min，恒流模式;進(jìn)樣量1 μL;分流比:1∶50;進(jìn)樣口溫度為280℃;電子轟擊(EI)離子源，電子能量70 eV;傳輸線溫度290℃;離子源溫度230℃;EM電壓1447.1 V;質(zhì)量掃描范圍m/z 29～800;溶劑延遲6 min。

2 結(jié)果與分析

以濃硫酸-醋酐為顯色劑，植物甾醇會產(chǎn)生紅→紫→藍(lán)→綠→污綠等顏色變化，最后褪色。因此可以通過測定反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度對甾醇總含量進(jìn)行定量分析。但L-B比色法的具體實驗條件卻不盡相同，包括反應(yīng)溫度，反應(yīng)時間，酸試劑與樣品的比例等。實驗參照改進(jìn)的L-B比色法［9］，利用可見分光光度法以膽固醇為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對馬尾松花粉植物甾醇粗提物中的總甾醇含量進(jìn)行測定。

植物甾醇顯色后光譜掃描結(jié)果顯示，在280 nm和620 nm處有兩個較強(qiáng)吸收峰，與梁博等人的光譜掃描結(jié)果相一致［10］。因此實驗選用可見光區(qū)的620 nm為L-B比色法測定馬尾松花粉中植物甾醇含量的檢測波長。

植物甾醇顯色過程中吸光值在0～12 min內(nèi)迅速上升，16～32 min內(nèi)在最大吸光值附近保持穩(wěn)定，之后緩慢下降。吸光值可以在較長時間內(nèi)保持相對穩(wěn)定，反應(yīng)溫和，因此實驗選擇在23℃水浴中反應(yīng)20 min后進(jìn)行測定，比色測定操作時間充足。

最后確定L-B比色法實驗條件為:以醋酐∶冰醋酸∶濃硫酸(6∶3∶1)為顯色劑，采用冰醋酸溶解樣品，取200 μL樣品溶液加入到5 mL顯色液中，23℃水浴反應(yīng)20 min后測定吸光值。以吸光值為縱坐標(biāo)，膽固醇濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:Y=0.17224x+0.00012，R2=0.99992，線性關(guān)系良好。測得馬尾松花粉中總甾醇含量為1.680 mg/g。

馬尾松花粉中植物甾醇TMS衍生物總離子流色譜圖見圖1。對比NIST08質(zhì)譜庫，以及相關(guān)研究中植物甾醇TMS衍生物的離子碎片數(shù)據(jù)［11-13］，發(fā)現(xiàn)8種可鑒別的甾醇成分。峰1鑒定為Δ5-菜油甾醇;峰2為豆甾醇;峰3與峰1(Δ5-菜油甾醇)相比，m/z M-129和m/z 129碎片離子豐度較低，鑒定為Δ7-菜油甾醇［14］;峰4 為 β-谷甾醇;峰5 鑒定為 Δ5-燕麥甾醇，峰5之前與之相鄰的雜質(zhì)峰為三十烷醇。峰6與干擾雜質(zhì)分離度較差，與質(zhì)譜庫的匹配度不高，結(jié)合文獻(xiàn)初步鑒定為禾本甾醇(質(zhì)譜圖見圖2)［15］;峰7質(zhì)譜圖中的m/z 69基峰，充分說明了C24上有雙鍵存在［14］，鑒定為環(huán)阿屯醇;峰8鑒定為24-亞甲基環(huán)木菠蘿烷醇，結(jié)果見表1和圖3。

表1 馬尾松花粉中植物甾醇GC-MS分析鑒定組分表Table 1 The identified phytosterol compositions of P.massoniana pollen

圖3 馬尾松花粉中植物甾醇結(jié)構(gòu)式Fig.3 Chemical structures of phytosterols in P.massoniana pollen

3 結(jié)論

為準(zhǔn)確分析馬尾松花粉不皂化物中植物甾醇組成，實驗直接對不皂化物衍生化，并進(jìn)樣分析，但馬尾松花粉不皂化物中高級烷醇等干擾雜質(zhì)較多，氣相分析中個別甾醇與雜質(zhì)峰重疊，難以進(jìn)一步分離，給甾醇的定量分析帶來困難，因此實驗采用改進(jìn)的L-B比色法，以膽固醇為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線對馬尾松花粉中植物甾醇總含量進(jìn)行定量分析，快速、經(jīng)濟(jì)、簡便，測得破壁馬尾松花粉中總甾醇含量為1.680 mg/g。實驗探索建立了適合于馬尾松花粉中植物甾醇總含量快速檢測的L-B比色法實驗條件，且并通過GC-MS分析鑒定出8種植物甾醇成分，其中以β-谷甾醇含量最多，Δ7-菜油甾醇、Δ5-燕麥甾醇、禾本甾醇、環(huán)阿屯醇、24-亞甲基環(huán)木菠蘿烷醇皆為在馬尾松花粉中首次檢出。

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