黃酮類化合物清除羥自由基(HO·)功能及其構(gòu)效關(guān)系研究

郭春梅，劉淑清，郭一萌，魚紅閃，孫明忠*

1大連醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)系;2大連醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，大連 116044;3大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，大連 116034

生物體在新陳代謝過程中會產(chǎn)生大量的自由基，自由基是具有未成對電子的原子團，具有很強的氧化活性。自由基的種類包括超氧陰離子自由基)、羥自由基 (HO·)等［1-4］。自由基可攻擊蛋白質(zhì)、DNA、脂類、核苷酸、碳水化合物等，誘導(dǎo)氧化損傷，導(dǎo)致癌癥、高血壓、糖尿病、動脈粥樣硬化、心肌梗塞、機體老化等多種疾病［5-7］。

黃酮類化合物是一種天然多酚類植物化學(xué)物，基本母核為2-苯基色原酮類化合物，由兩個苯環(huán)(A環(huán)和B環(huán))通過中間雜環(huán)吡喃或吡喃酮相連接，即具有15個相連碳原子核心結(jié)構(gòu)的化合物［8，9］。根據(jù)取代基團的不同，可以分為黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、二氫黃酮醇、異黃酮、二氫異黃酮等［10-12］。黃酮類化合物具有多種生物學(xué)活性，如抗炎、抗自由基、抗氧化、抗血小板聚集、抗腫瘤、抗病毒、降壓、降血脂等作用，可以預(yù)防和治療心腦血管疾?。?3，14］。黃酮類化合物是一類有效的天然抗氧化劑，對氧自由基有較好的清除作用，具有抗自由基損傷和保護機體各組織的作用，而黃酮類化合物結(jié)構(gòu)上的差異會導(dǎo)致其生物學(xué)活性的變化，其抗自由基能力完全依賴于其特殊的結(jié)構(gòu)［15-17］。

我們采用體外實驗的方法，通過Fenton反應(yīng)體系產(chǎn)生HO·，系統(tǒng)地研究了八種黃酮類植物化學(xué)物槲皮素 (quercetin)、異槲皮素 (isoquercitrin)、蘆丁 (rutin)、橙皮素 (hesperetin)、橙皮苷 (hesperidin)、柚皮素 (naringenin)、柚皮苷 (naringin)和淫羊藿苷(icariin)(圖1)對HO·的清除作用。通過作用活性比較，探討黃酮類化合物抗HO·的作用及其構(gòu)效關(guān)系，為選擇有效的黃酮類化合物預(yù)防和治療相關(guān)疾病提供一定實驗基礎(chǔ)，并為其進一步開發(fā)和臨床應(yīng)用提供實驗理論依據(jù)。

圖1 八種黃酮類植物化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structures of eight flavonoid phytochemicals

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

槲皮素、異槲皮素、蘆丁、橙皮素、橙皮苷、柚皮素、柚皮苷和淫羊藿苷由大連工業(yè)大學(xué)提供;硫酸亞鐵(FeSO4)，過氧化氫 (H2O2)，水楊酸，無水乙醇和二甲基亞砜 (DMSO)均為國產(chǎn)分析純;UV-754分光光度計為上海菁華科技儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 黃酮類植物化學(xué)物純度分析

取八種黃酮類化合物各0.55 mg，分別用2 mL甲醇溶解，0.2 μm 過濾器過濾后，分別取 10 μL 樣品用Waters 2690/996高效液相色譜儀(HPLC)檢測其純度。色譜條件:Intersil ODS-3 C18色譜柱(4.6 × 250 mm);流動相:甲醇:0.2%磷酸 (60∶40);柱流速:1.0 mL/min;檢測波長:槲皮素、異槲皮素、蘆丁、柚皮素和柚皮苷采用254 nm，橙皮素和橙皮苷為283 nm，淫羊藿苷為270 nm;柱溫25℃。

1.3 黃酮類植物化學(xué)物對HO·清除作用

Fenton反應(yīng)是對生物體內(nèi)HO·清除的體外模擬反應(yīng):Fe2++H2O2→Fe3++HO· +OH-。HO·氧化水楊酸產(chǎn)生有色物質(zhì)2，3-二羥基苯甲酸，后者在510 nm處有強吸收。若在反應(yīng)體系中加入具有清除HO·的物質(zhì)，便會與水楊酸競爭HO·，從而使有色生成物減少，吸光度降低。在反應(yīng)體系中加入1.5 mM的FeSO4溶液，9 mM的水楊酸乙醇溶液和用DMSO配制的八種黃酮類化合物溶液各1 mL，最后加入1 mL 9 mM的H2O2溶液啟動反應(yīng)?？紤]到黃酮類化合物本身的吸光度，實驗中用1.5 mM的FeSO4溶液，9 mM的水楊酸乙醇溶液和八種黃酮類化合物溶液及三蒸水各1 mL體系作為本底吸收。37℃反應(yīng)0.5 h后，在510 nm處測吸光度。其HO·的清除率(%)=［A0-(AX-AX0)］/A0*100%，A0為對照試驗的吸光度值，Ax為加入黃酮類化合物溶液的吸光度值，Ax0為作為本底吸收的吸光度值。所有實驗結(jié)果是三次測定數(shù)據(jù)的平均值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS11.5統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結(jié)果用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示，差異檢驗用方差分析和t檢驗，P＜0.05表示差異有顯著性。

2 結(jié)果與討論

2.1 黃酮類植物化學(xué)物純度分析

通過計算HPLC峰面積和峰強度，得到八種黃酮類化合物的純度均超過95%(表1)，說明用于本實驗的黃酮類化合物是高純度的，確保了實驗結(jié)果的可信度、準(zhǔn)確性。

表1 八種黃酮類植物化學(xué)物純度HPLC檢測結(jié)果Table 1 The purity determinations of eight flavonoid phytochemicals by HPLC

Isoquercitrin(異槲皮素) 4.512 ±0.012 97.12 ±0.016 97.20 ±0.020 Rutin(蘆丁) 4.404 ±0.009 99.33 ±0.027 99.33 ±0.023 Naringenin(柚皮素) 7.379 ±0.021 95.64 ±0.017 95.10 ±0.019 Naringin(柚皮苷) 4.261 ±0.009 95.06 ±0.036 95.31 ±0.025 Hesperetin(橙皮素) 7.833 ±0.015 95.85 ±0.032 95.02 ±0.027 Hesperidin(橙皮苷) 4.350 ±0.016 96.53 ±0.022 96.78 ±0.034 Icariin(淫羊藿苷)9.781 ±0.019 96.85 ±0.025 96.29 ±0.028

2.2 不同濃度槲皮素對HO·清除作用

HO·是人體中最活躍、對機體危害最大的自由基，它可與脂類、蛋白質(zhì)、DNA等反應(yīng)，引發(fā)不飽和脂肪酸氧化，形成脂質(zhì)過氧化物 (LPO)，破壞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細胞和組織器官損傷，誘發(fā)多種疾病［18］。槲皮素對Fenton體系產(chǎn)生的HO·具有一定清除作用，并呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)，在實驗濃度范圍內(nèi)(19.89 ～662.91 μM)，隨著槲皮素濃度的增加，對HO·的清除作用也增強 (圖2)。

圖2 不同濃度槲皮素對HO·清除作用Fig.2 The HO·scavenging activity of different concentrations quercetin

2.3 黃酮類植物化學(xué)物對HO·清除作用

黃酮類化合物種類繁多，并不是所有的黃酮類化合物都具有清除自由基的功能，其抗自由基能力完全依賴于其特殊結(jié)構(gòu)。在濃度260 μM時，八種黃酮類化合物中只有槲皮素、異槲皮素和蘆丁對HO·呈現(xiàn)明顯的清除作用，橙皮素、橙皮苷、柚皮素、柚皮苷和淫羊藿苷不呈現(xiàn)清除HO·的功能(圖3)。槲皮素清除HO·的作用最強，清除率為30.69%，其次為蘆丁13.70%，異槲皮素稍小為10.23%(表2)。

圖3 八種黃酮類植物化學(xué)物對HO·清除作用Fig.3 The HO·scavenging activity of eight flavonoid phytochemicals

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黃酮類化合物酚羥基的氫原子直接參與自由基的清除，可將自身氫原子供給自由基，使自由基氧化活性減弱，而自身則成為黃酮自由基，黃酮自由基的穩(wěn)定性較高，難以對其他分子造成破壞。所以黃酮類化合物清除自由基的能力與作為活潑的氫供體的酚羥基有著密切的關(guān)系，故黃酮類化合物酚羥基數(shù)目越多，提供氫質(zhì)子能力越強，黃酮類化合物清除自由基能力就越強［8，19，20］。八種黃酮類化合物中，槲皮素有5個自由酚羥基，其酚羥基數(shù)目最多，所以槲皮素呈現(xiàn)最強的清除HO·的能力。

C環(huán)C3羥基也是抗自由基的活性基團，這與C環(huán)C3羥基在失去一個質(zhì)子后，由于結(jié)構(gòu)中的共軛作用及C環(huán)上的羰基的吸電子作用，而使其更加穩(wěn)定相關(guān)［19-22］。槲皮素與異槲皮素和蘆丁的結(jié)構(gòu)差異在于C環(huán)C3位上基團的不同，槲皮素為羥基，而異槲皮素和蘆丁分別為O-(-Glc和O-Glc-(-Rha糖苷基。由于C環(huán)C3位羥基的缺失，異槲皮素和蘆丁清除HO·的能力比槲皮素分別降低了～66.67%和～55.36%。由此可見:C環(huán)C3位羥基基團是黃酮類化合物抗HO·的關(guān)鍵活性基團。

黃酮類化合物中各羥基活性相差很大，其中B環(huán)3’-4’鄰位二羥基結(jié)構(gòu)活性最高，而A環(huán)上的羥基活性最弱。B環(huán)上的3’-4’鄰位二羥基，在失去氫后，可以形成分子內(nèi)氫鍵或是通過共軛形成鄰苯醌結(jié)構(gòu)，從而降低了分子的自由能提高穩(wěn)定性［14，17］。橙皮素、柚皮素、橙皮苷和柚皮苷四種黃酮類化合物都不具有清除HO·的作用，其結(jié)構(gòu)的差別主要是苷及其苷元的差別，即橙皮苷和柚皮苷A環(huán)的C7位由相應(yīng)苷元的羥基取代變?yōu)樘擒栈〈Y(jié)構(gòu)上的變化對它們清除HO·的作用影響不大，即說明A環(huán)C7位羥基不是黃酮類化合物抗HO·的活性基團。通過淫羊藿苷與柚皮苷的結(jié)構(gòu)比較，可以得出C環(huán)C2-C3雙鍵對抗HO·的活性作用不大。由先前比較可知，A環(huán)C7位羥基和C環(huán)C2-C3雙鍵不是黃酮類化合物抗HO·的活性基團，所以異槲皮素、蘆丁和橙皮素的比較主要看B環(huán)3’-4’鄰位二羥基結(jié)構(gòu)，可以得出B環(huán)3’-4’鄰位二羥基結(jié)構(gòu)也可能是黃酮類化合物抗HO·的關(guān)鍵基團。

總之，黃酮類化合物清除自由基的作用與酚羥基有很大的關(guān)系，其酚羥基數(shù)目、C環(huán)C3位羥基和B環(huán)3’-4’鄰位二羥基在一定程度上影響著它們的抗自由基活性。本研究有助于揭示黃酮類化合物中不同的羥基基團與清除HO·之間的關(guān)系，其確切機制還有待進一步研究。

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