Botryosphaeria rhodina A13對離體白木香形成沉香組分的作用研究

陶美華，王 磊，高曉霞，章衛(wèi)民*

1廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點實驗室廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實驗室廣東省華南應(yīng)用微生物重點實驗室省部共建國家重點實驗室培育基地廣東省微生物研究所，廣州 510070;2廣東藥學(xué)院，廣州 510006

白木香［Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg］又稱土 沉香，屬瑞香科沉香屬植物，為我國特有的熱帶及亞熱帶常綠喬木，是我國生產(chǎn)沉香的唯一植物資源。當(dāng)白木香樹干受到損傷或刺激時會分泌一種黑色樹脂，即為沉香樹脂。沉香是一種名貴中藥，其藥用始載于《名醫(yī)別錄》，列為上品。其味辛、苦，性微溫，具行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘功效，用于治療胸腹脹悶疼痛、胃寒嘔吐呃逆、腎虛氣逆喘急等癥［1］。此外，它還是一種在亞洲廣受歡迎和廣泛應(yīng)用的傳統(tǒng)名貴天然香料。沉香的化學(xué)成分主要包括倍半萜類和2-(2-苯乙基)色酮類，按結(jié)構(gòu)類型來分，倍半萜類有沉香呋喃類、杜松烷類、桉烷類、大根香葉烷類等［2］。目前，白木香形成沉香的機(jī)理和過程并不清楚。

不少研究顯示，沉香屬植物結(jié)香與真菌相關(guān)。自20世紀(jì)30年代，從沉香屬植物結(jié)香部位分離到的真菌有葡萄座腔菌(Botryosphaeria rhodina)、色二孢菌(Diplodia sp.)、鐮刀菌(Fusarium sp.)、曲霉(Aspergillus sp.)、毛霉(Mucor sp.)、青霉(Penicillium sp.)、木霉(Trichoderma sp.)、裂褶菌(Schizophyllum sp.)等［3］。在本課題組的前期研究中，從白木香不同部位分離到20多株真菌［4］。人工造香實驗發(fā)現(xiàn)葡萄座腔菌菌株B.rhodina A13侵染的促香效果顯著。與空白對照相比，它能使白木香快速產(chǎn)生黃褐色沉香樹脂［5］。在此基礎(chǔ)上，我們又對不同來源的白木香結(jié)香部位真菌類群進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)葡萄座腔菌是結(jié)香部位的優(yōu)勢真菌。我們的研究結(jié)果和馮乃憲的基本一致，他從沉香木塊中分離到9株真菌，通過菌種對沉香組成成分芐基丙酮的耐受性實驗、菌種接種后人工結(jié)香木材寬度、燃燒香味比較，發(fā)現(xiàn)葡萄座腔菌有促進(jìn)結(jié)香作用。他還對其促進(jìn)結(jié)香后精油成分進(jìn)行了GC-MS分析，發(fā)現(xiàn)含有沉香倍半萜類沉香螺旋醇以及萘酮類、酚類等沉香形成前體成分［6］。此外，魏建和的研究結(jié)果也證實葡萄座腔菌是一種產(chǎn)沉香的誘導(dǎo)劑［7］。

為了研究真菌對白木香形成沉香的作用機(jī)理，研究人員采用了野外植株接種實驗［5-7］和懸浮細(xì)胞培養(yǎng)方法［8］。野外植株接種實驗?zāi)芊从嘲啄鞠憬Y(jié)香的真實情況，但實驗周期長，且容易受環(huán)境中土壤、害蟲、氣候等諸多因素影響。懸浮細(xì)胞培養(yǎng)方法條件可控，方法簡單，但存在的主要問題是與植株實驗有差異，如研究表明在植株水平上可以在病原菌侵染部分形成局部高濃度活性氧而起一定作用，但在懸浮細(xì)胞系統(tǒng)中就不能形成這種局部效應(yīng)［9］。為此，本研究參照植物病理學(xué)文獻(xiàn)［10］，首次建立了一種離體白木香枝條實驗?zāi)Ｐ?，為研究真菌誘導(dǎo)白木香形成沉香的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料

內(nèi)生真菌Botryosphaeria rhodina A13分離自白木香結(jié)香部位，保藏在廣東省微生物菌種保藏中心;新鮮白木香樹枝采自中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所實驗基地;沉香醇浸膏由廣東省信宜市珍稀沉香發(fā)展有限公司提供。

1.2 儀器

RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠;SHZ-D(II)型循環(huán)水式真空泵，鞏義市英峪予華儀器廠;DLSB-5/10低溫冷卻液循環(huán)泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司;FA2004電子分析天平，上海天平儀器廠;超凈工作臺，上海恒益科技有限公司;LRH-250-G光照培養(yǎng)箱，廣東省醫(yī)療器械廠;Thermo Trace DSQ型色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Thermo Finnigan公司。

2 實驗方法

2.1 離體白木香枝條接種試驗

2.1.1 菌種活化

保藏于低溫冰箱中的菌株B.rhodina A13挑取少量菌絲體接種到經(jīng)高壓滅菌的PDA斜面上，28℃培養(yǎng)7 d進(jìn)行菌種活化。

2.1.2 白木香枝條的表面消毒

將粗約0.5～1 cm的新鮮白木香枝條切成約8 cm左右的小段，先在0.1%升汞溶液中浸泡3～7 min，取出后用無菌水漂洗3～4次，再放入75%乙醇中浸泡3～7 min，無菌水漂洗3～4次，然后用滅過菌的打孔器在白木香枝條上打孔。

2.1.3 接種

將打孔后白木香枝條放入有濕潤無菌濾紙的培養(yǎng)皿上。用5 mL無菌水沖洗真菌B.rhodina A13斜面菌種，用大頭吸管吸取菌液，注入到打孔的白木香枝條上。接種后培養(yǎng)皿用保鮮膜封口，在黑暗、27℃環(huán)境中放置20 d。同時設(shè)置未接菌的新鮮白木香枝條對照組和在PDA培養(yǎng)7 d的菌株A13菌絲對照組，每個實驗組設(shè)置3個平行。

2.2 樣品前處理及GC-MS分析

2.2.1 樣品前處理

將各實驗組樣品放入三角瓶中，加入95%乙醇浸泡過夜，提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)至干，用1.5 mL氯仿溶解后過0.22 μm微孔濾膜，待用。設(shè)置沉香對照組，將沉香醇浸膏用氯仿溶解并過微孔濾膜后備用。

2.2.2 GC-MS 分析

氣相色譜條件:Agilent毛細(xì)管色譜柱DB-5MS(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm);色譜柱程序升溫條件:初始柱溫60℃(保持2 min)，以5℃/min升至150℃，再以1℃/min升至160℃(保持15 min)，再以8℃/min升至250℃(保持20 min);傳輸線溫度250℃，載氣為高純氦氣，流速1.0 mL/min;進(jìn)樣量1 μL，程序升溫汽化不分流進(jìn)樣，初始溫度60℃，14.5℃/min升溫至250℃。

質(zhì)譜條件:電子轟擊(EI)離子源，離子源溫度230℃;掃描質(zhì)量范圍(m/z)40～500。

各實驗組組分采用NIST2002質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索進(jìn)行定性，采用色譜峰面積歸一法進(jìn)行相對定量。

3 實驗結(jié)果

3.1 菌株A13在離體白木香樹枝上的培養(yǎng)特征

在接種后2～4 d，離體白木香樹枝打孔處長出白色菌絲體。隨著培養(yǎng)時間的延長，在9～12天，菌絲布滿整條樹枝以及平皿上的濾紙，顏色由白色變成黑色(圖1)。

3.2 GC-MS 分析結(jié)果

圖1 菌株A13在離體白木香樹枝上的培養(yǎng)特征Fig.1 Cultural characteristic of strain A13 in Aquilaria sinensis excised twig

(菌株A13+樹枝)實驗組的提取物采用GCMS鑒定出11個化合物，其化學(xué)成分主要是吡喃酮、脂肪酸、烷醇和萜類，其中萜類化合物包括2，6-二甲基，1，7-辛二烯-3-醇、異葉綠醇、葉綠醇、3，7，11-三甲基，1-月桂醇和5，9-二甲基-2-(1-甲基亞乙基)-環(huán)癸醇。沉香對照組提取物中鑒定出24個化合物，其化學(xué)成分主要是萜類、脂肪酸和烷醇類，其中萜類化合物包括反-松香芹醇、雙環(huán)大根香葉烯、香橙烯、綠花白千層醇、5，9-二甲基-2-(1-甲基亞乙基)-環(huán)癸醇。樹枝對照組提取物中鑒定出8個化合物，主要是脂肪酸和烷醇類。菌株A13對照組提取物鑒定出9個化合物，主要是炔類、脂肪酸和烷醇類(表1，圖2)

表1 各實驗組GC-MS分析結(jié)果Table 1 GC-MS identification results of chemical constituents of experimental groups

樹枝對照組Excised twigs control group 4 21.70 (Z，Z)-9，12-Octadecadien-l-ol，亞麻醇 0.64 5 25.11 Bicyclo［3.3.1］nonan-2-ol，endo，雙環(huán)［3.3.1］2-壬醇 0.76 6 28.02 Carbamic acid，氨基甲酸 0.79 7 28.36 Cyclopentanemethanol，2，2-dimethyl，2-環(huán)戊烷-2-丙醇 1.23 8 28.58 Methylenecyclooctane，亞甲基環(huán)辛烷 0.53 9 28.97 2-Methyl-oct-2-enedial 0.33 10 29.30 7-Octen-2-ol，2-methyl-6-methylene，月桂烯醇 1.45 11 30.42 2(1H)-Naphthalenone，Octahydro-1-methyl，2(1H)-萘酮，八氫-1-甲基 2.01 12 39.77 5-hydroxy-4-hydroxymethyl-1-［1-hydroxyl-1-isopropyl］ cyclohex-3-ene，5-羥基-4-羥甲基-1-［1-羥基-1-異丙基］環(huán)己-3-烯 5.58 13 48.85 9，12，15-Octadecatrienoic acid，methylester，亞麻酸甲酯 1.42 14 49.67 3-tetradecanynoic acid 1.68 15 50.78 Cyclohexaneacetic acid，2-ethyl，2-環(huán)己烷丁酸 4.45 16 51.72 3-Tetradecanynoic acid，3-十四碳烯酸 4.88 17 52.49 Aromadendrene，香橙烯 5.40 18 54.34 13-Octadecenal，13-十八碳醛 9.53 19 54.48 1-Hexadecanol，1-十六烷醇 15.56 20 54.92 4-Decenoic acid，ethylester，(Z)-4-癸烯酸乙酯 1.00 21 57.23 Sulfoxide，methyl phenethyl 3.91 22 62.54 Benzeneacetic acid，phenylmethylester，苯乙酸苯甲酯 4.00 23 63.35 Viridiflorol，綠花白千層醇 0.33 24 68.915，9-Dimethyl-2-(1-methylethyldene)-1-cyclodecanol，5，9-二甲基-2-(1-甲基亞乙基)-環(huán)癸醇 0.27菌株A13對照組Strain A13 control group 1 16.08 2H-Pyran-2-one，5，6-dihydro-6-pentyl，5，6-二氫-6-戊基-2H-吡喃-2-酮 2.94 2 42.40 Disulfide，1，1-dimethylethylethyl，二硫化合物，1，1-二甲基乙基，乙基 3.16 3 49.21 Benzenebutanoic acid，3-nitro-oxo，3-硝基-3-苯甲?；?1.93 4 50.21 Nonanoid acid，壬酸 8.88 5 50.83 Tetradecanoic acid，ethylester，肉豆蔻酸乙酯 10.82 6 54.25 Hexadecenoic acid 0.08 7 54.53 1-Hexadecanol，1-十六烷醇 37.75 8 59.74 1-Decanol，2-hexyl，2-己基-1-癸醇 3.49 1 16.23 2H-Pyran-2-one，5，6-dihydro-6-pentyl，5，6-二氫-6-戊基-2H-吡喃-2-酮 16.02 2 23.31 1-Hepten-4-ol，1-庚烯-4-醇 3.47 3 50.50 Undecanoic acid，十一烷酸 9.03 4 50.78 Tetradecanoic acid，ethylester，肉豆蔻酸乙酯 3.65 5 53.06 1-Pentadecyne，1-十五炔 2.50 6 54.39 ［Z］，6，［Z］9-Pentadecadien-1-ol，［Z］，6，［Z］9-十五烷二烯-1-醇 8.04 7 54.49 Oleyl Alcohol，油醇 9.04 8 54.67 9-Octadecyne，9-十八炔 29.31 9 54.96 Ethyl 9-decenoate，9-癸酸乙酯3.90

圖2 實驗組提取物的GC-MS總離子流色譜圖Fig.2 GC-MS total ion chromatograms of extracts from experimental groups

4 討論

研究結(jié)果顯示，未接菌的離體白木香樹枝對照組和PDA培養(yǎng)7 d的菌株B.rhodina A13對照組提取物中未檢出萜類化合物，而接種A13菌株的離體白木香樹枝實驗組和沉香對照組中都有萜類化合物，包括大根香葉烷類倍半萜5，9-二甲基-2-(1-甲基亞乙基)-環(huán)癸醇。這說明菌株A13能誘導(dǎo)離體白木香枝條形成沉香倍半萜類化合物。此離體實驗?zāi)苣M野外植株接種實驗，在野外植株接種實驗中已證實有促進(jìn)結(jié)香作用的真菌A13在離體條件下同樣也能誘導(dǎo)沉香組分的產(chǎn)生。與野外植株實驗和懸浮細(xì)胞培養(yǎng)實驗相比，離體實驗具有條件可控，方法簡單，并且又接近白木香植物自然結(jié)香狀況等優(yōu)點，該實驗方法可作為研究真菌誘導(dǎo)白木香形成沉香作用機(jī)理的實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

1 Chinese Pharmacopoeia Commission(國家藥典委員會).Pharmacopoeia of the People’s Republic of China(中華人民共和國藥典).Beijing:China Medical Science Press，2010.Vol I，172.

2 Naef R.The volatile and semi-volatile constituents of agarwood，the infected heartwood of Aquilaria species:A review.Flavour Frag J，2011，26:73-89.

3 Zhang Z(張爭)，Yang Y(楊云)，Wei JH(魏建和)，et al.Advances in studies on mechanism of agarwood formation in Aquilaria sinensis and its hypothesis of agarwood formation induced by defense response.Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，2010，41:156-159.

4 Wang L(王磊)，Zhang WM(章衛(wèi)民)，Pan QL(潘清靈)，et al.Isolation and molecular identification of endophytic fungi from Aquilaria sinensis.J Fun Res(菌物研究)，2009，7:37-42.

5 Wang L(王磊)，Zhang WM(章衛(wèi)民)，Gao XX(高曉霞)，et al.An artificial method inducing Aquilaria sinensis to generate agarwood(一種人工誘導(dǎo)白木香產(chǎn)生沉香的方法).CN102302041A，2012-01-04.

6 Feng NX(馮乃憲).Preliminary study on endophytic fungi of Aquilaria sinensis.Nanchang:Nanchang University(南昌大學(xué))，M Sc.2008.

7 Wei JH(魏建和)，Zhang Z(張爭)，Yang Y(楊云).An incense induction agent and its preparation method(一種沉香誘導(dǎo)劑及其制備方法).CN101731282A，2010-06-16.

8 Okudera Y，Ito M.Production of agarwood fragrant constituents in Aquilaria calli and cell suspension cultures.Plant Biotechnol，2009，26:307-315.

9 Kolewe ME，Gaurav V，Roberts SC.Pharmaceutically active natural product synthesis and supply via plant cell culture technology.Mol Pharmacol，2008，5:243-256.

10 Savocchia S，Steel CC，Stodart BJ，et al.Pathogenicity of Botryosphaeria species isolated from declining grapevines in subtropical regions of eastern Australia.Vitis，2007，46:27-32.