一株萘降解菌的篩選及其降解途徑

王 博，劉兆普，隆小華，姚 瑤，黃玉玲

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江蘇省海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095

多環(huán)芳烴(PAHs)在環(huán)境中分布廣泛，是一類化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，具有誘變性和致癌性的污染物，它可通過生物鏈的傳遞進(jìn)行富集，對(duì)環(huán)境和人類造成極大的危害。微生物在PAHs的降解過程中起著重要作用，因此，PAHs的生物降解途徑成為國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)［1］。篩選對(duì)PAHs有較強(qiáng)耐受性和降解性的菌株和菌系，對(duì)于污染的治理具有重要的意義。

萘(naphthalene)是PAHs的代表性化合物，為無(wú)色片狀晶體，熔點(diǎn)80.5℃，沸點(diǎn)218℃，不溶于水，但易于溶于熱的乙醇和乙醚，具揮發(fā)性。萘廣泛存在于油田污染的土壤和水體中，對(duì)周圍的生態(tài)環(huán)境和人類健康危害極大，已被美國(guó)環(huán)保署(EPA)確定為重點(diǎn)污染物，也是我國(guó)嚴(yán)格控制的一類污染物［2］。不同于物理和化學(xué)方法，萘的微生物治理方法優(yōu)勢(shì)明顯，低成本，效果佳，無(wú)污染，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效應(yīng)［3］。

國(guó)內(nèi)外做了大量的工作不斷豐富萘降解菌種，篩選培育高萘降解率菌株，一些菌株的萘降解率可以達(dá)到 99.6% 以上［4］。宋昊等［5］研究了一株帕氏氫噬胞菌的萘降解特性，在萘質(zhì)量濃度為39.8 mg/L時(shí)，培養(yǎng)96 h，其萘降解率可達(dá)98%，但其底物濃度耐受低，對(duì)溫度變化敏感，28℃為生長(zhǎng)最適溫度。蔡寶立等［6］發(fā)現(xiàn)的一株假單胞菌，能耐受萘質(zhì)量濃度為2 g/L，但菌株在pH 6.0下生長(zhǎng)受到抑制，此外該菌還能利用一些芳香族化合物為唯一碳源。李文等［7］在濱海濕地紅樹林中篩選出了4株萘降解菌，萘濃度為100 mg/L的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d，萘降解率最高為54.2%。目前為止，已發(fā)現(xiàn)的具有萘降解能力的菌種遍布假單胞菌(Pseudomonas)、紅球菌(Rhodococcus)、微球菌(Micrococcus)、產(chǎn)堿菌(Alcaligenes)、棒狀桿菌(Corynebacteria)以及真菌和藻類等。萘的生物降解途徑主要分兩種，一種為鄰苯二酚途徑，萘在編碼酶的作用下生成水楊酸，而后轉(zhuǎn)化為鄰苯二酚，經(jīng)間位或者鄰位裂解開環(huán)，降解為一系列可進(jìn)入三羧酸循環(huán)的小分子物質(zhì)，其代表菌株為Pseudomonas［8］。另一條途徑為龍膽酸途徑，萘氧化為水楊酸后，在水楊酸5-羥化酶的作用下，生成龍膽酸，經(jīng)過一系列的氧化進(jìn)行降解［9］。本研究從濱海鹽堿地受石油污染的土壤中分離到一株萘降解菌W1，經(jīng)過生理生化以及分子鑒定為沙雷氏菌屬，研究了該菌萘降解特性和底物利用的特性，分析了該菌萘降解過程的中間產(chǎn)物，探討了其可能的萘降解途徑，為濱海鹽堿土壤中萘以及多環(huán)芳烴的污染治理提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

石油污染土樣采集于勝利油田;萘，環(huán)己烷(Cyclohexane，純度大于99.5%)購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;透射電鏡型號(hào)為日立H-7650(工作電壓80 kV)。

1.2 主要培養(yǎng)基

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基:NH4NO310 g，KH2PO41.5 g，K2HPO43.0 g，加入微量元素液 2 mL，水 1 L，pH 7.5，固體加2%瓊脂。

微量元素液:MgSO44 g，CuSO41 g，MnSO41 g，F(xiàn)eSO41 g，CaCl21 g，水 1 L。

萘溶液:5 g萘溶于1 L正己烷，配成5 mg/mL的濃縮液，常溫避光保存。

固體含萘培養(yǎng)基:無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，加入0.2%微量元素液，1%萘溶液。

菌株馴化培養(yǎng)基:1 L 50 mg/L含萘培養(yǎng)基加入0.05 g酵母膏。

1.3 萘降解菌的篩選與分離

稱取10 g的石油污染土樣加入到90 mL無(wú)菌水中，200 rpm，28℃振蕩培養(yǎng)1 h后，靜置30 min，吸取10 mL上清液于菌株馴化培養(yǎng)基，在200 rpm，28℃條件下?lián)u床培養(yǎng)5 d。待培養(yǎng)液混濁后，吸取5 mL培養(yǎng)液重新轉(zhuǎn)接入新鮮的與上述相同的菌株馴化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件保持不變，連續(xù)轉(zhuǎn)接馴化培養(yǎng)5次。將第5次搖床培養(yǎng)得到的菌液系列稀釋后，取0.1 mL涂布于固體含萘培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)2 d，連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)3次，挑出單菌落，得到能夠以萘為唯一碳源的菌株。

1.4 萘降解率的測(cè)定［10］

在100 mL含萘水樣中接種N7菌液，另設(shè)不接菌100 mL含萘水樣作為空白對(duì)照，經(jīng)搖床振蕩培養(yǎng)3 d后，加入20 mL正己烷萃取，轉(zhuǎn)至分液漏斗，振蕩1 min，靜置，待分層后分離，收集上層液，再用10 mL正己烷萃取2次下層液體，合并上層液用干燥的無(wú)水Na2SO4脫水，45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，N2吹干后，用甲醇定容至1 mL，待測(cè)。以同步不加菌液搖床振蕩的含萘水樣為空白對(duì)照。Agilent 1100 Series HPLC分析條件:分離柱為 ZORBAX SB-Aq(5 μm，250 mm×416 mm);柱溫27 ℃，流速 0.18 mL/min，流動(dòng)相為乙腈/水=50/50;檢測(cè)波長(zhǎng)218 nm。

降解率的計(jì)算公式為:

式中，m1為對(duì)照組的萘殘余質(zhì)量(mg)，m2為樣品的萘殘余質(zhì)量(mg)。

1.5 菌種的鑒定

1.5.1 生理生化鑒定

對(duì)篩選出的細(xì)菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定［11］，初步鑒定到屬。

1.5.2 降解菌株的16S rDNA的鑒定

細(xì)菌總DNA的提取方法及PCR操作參考文獻(xiàn)［12］。

以總DNA為模板，用16S rDNA的專一性引物F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和 R:5’-GGT TACCTTGTTACGACTT-3’，目的片段大小為1500 bp左右。用TaqDNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆至pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株，DNA測(cè)序。

將測(cè)得的16S rDNA序列在GenBank中BLAST查找相似的核苷酸序列，用DNAMAN(version 4.0，Lynnon Biosoft)軟件進(jìn)行比對(duì)，來(lái)推測(cè)鑒定菌株。

1.5.3 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

用濁度法測(cè)定W1菌株的生長(zhǎng)曲線［13］。將W1菌株分別接種于LB培養(yǎng)基和以萘為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，分別每隔2 h和6 h，取接菌和不接菌培養(yǎng)基測(cè)定其OD600值，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.6 菌株降解特性分析

將菌種接種于100 mL萘質(zhì)量濃度為100 mg/L的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，每次確定一個(gè)因素為變量(底物濃度、pH值、鹽度、溫度)，其他因素不變，并設(shè)空白對(duì)照組，搖床培養(yǎng)3 d測(cè)定其萘殘留量，計(jì)算萘降解率。其中，溫度可設(shè)為 20、25、30、35、40 ℃;初始pH 值可設(shè)為為 5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5;鹽度(NaCl)為 0、2、5、10、15、20、30、40 g/L;萘濃度分別為50、100、200、500 和800 mg/L。

1.7 菌株對(duì)不同底物的降解效應(yīng)

以苯酚、甲苯、苯甲酸、1-萘酚、丙酮、辛烷為試驗(yàn)底物，經(jīng)0.45 μL過濾除菌后以0.01%的量分別加入到100 mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中。接菌液0.5 mL，并設(shè)空白對(duì)照，30℃下?lián)u床培養(yǎng)3 d，測(cè)定其OD600值。

1.8 菌株對(duì)原油各組分的降解效應(yīng)［14］

在100 mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入0.45 μL濾器過濾除菌的原油0.5%，制成原油培養(yǎng)基。接菌液0.5 mL，并以不接菌的原油培養(yǎng)基作為對(duì)照，30℃搖床培養(yǎng)3 d，加入10 mL石油醚(沸程30～60℃)萃取，并將培養(yǎng)液5000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)至分液漏斗，振蕩數(shù)次，靜置分層后，收集上層液，用石油醚洗滌3次后，用無(wú)水NaSO4脫水，65℃蒸干，置于干燥器中冷卻。將回收得到的殘油溶解在石油醚(沸程30～60℃)中，通過GC-MS分析烷烴變化。GCMS(色譜柱 HP-5 M5，30 m ×0.25 mm ×0.25 μm)運(yùn)行條件:采用分流進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度為290℃，檢測(cè)器溫度為300℃，柱溫80℃，恒溫5 min，以3℃/min升溫至290℃，保留10 min;載氣為He，流速1 mL/min。

1.9 菌株降解途徑的分析

將菌株接種于含萘無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4 d，分別在 0、12、16、20、24、28、32、36、42、48、60、72 和96 h時(shí)取樣，于4℃、12500 r/min離心20 min，取上清液用Spectrumlab 54紫外可見分光光度計(jì)(UVVis)對(duì)萘降解中間產(chǎn)物進(jìn)行分析檢測(cè)。波長(zhǎng)掃描范圍為200～500 nm，掃描光譜帶寬為2 nm，繪制掃描圖譜［15］。

2 結(jié)果與討論

2.1 高效萘降解菌的篩選和鑒定

經(jīng)過反復(fù)的富集篩選，以及初步的萘降解率測(cè)定，從石油污染土樣中分離到一株高效萘降解菌，命名為W1，其菌落為白色透明，中間略突起，邊緣不規(guī)則，表面光滑濕潤(rùn)。菌株的透射電鏡結(jié)果顯示，菌體呈橢圓形，具鞭毛(圖1)。菌株為革蘭氏陽(yáng)性菌，其部分生理生化特性見表 1。其16S rDNA的BLAST結(jié)果顯示，該菌與沙雷氏菌屬的同源性均在97%以上，綜上結(jié)果，鑒定該菌為沙雷氏菌屬(Serratia sp.)。

圖1 菌株W1單菌落形態(tài)和電鏡照片F(xiàn)ig.1 Shape of individual bacterial colony and transmission electron micrograph of strain W1

表1 W1菌株的部分生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain W1

2.2 菌株的生長(zhǎng)曲線

每隔2 h測(cè)定菌株在LB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況，其生長(zhǎng)曲線如圖2所示，菌株在0～6 h為遲滯期，6～18 h為對(duì)數(shù)期，12 h后進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期，后續(xù)試驗(yàn)，接種時(shí)間均取自對(duì)數(shù)期。每隔6 h測(cè)定菌株在萘無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況，由于萘對(duì)菌株的毒害作用，菌株遲滯期持續(xù)18 h，而后逐漸適應(yīng)，46 h時(shí)達(dá)到最大生長(zhǎng)量，在66 h進(jìn)入明顯的衰亡期，其穩(wěn)定期約持續(xù)20 h。

圖2 菌株W1在LB培養(yǎng)基(A)和萘培養(yǎng)基(B)中的生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curve of strain W1 on LB medium and naphthalene medium

2.3 菌株降解特性的分析

2.3.1 溫度對(duì)菌株的影響

菌株受溫度的影響結(jié)果如圖3所示，其在30～35℃時(shí)表現(xiàn)出較高的萘降解率，分別達(dá)到87.5%和92.8%，而在其他溫度下，其降解率也都在40%以上，也具有一定的降解效應(yīng)，說明菌株的耐受溫度范圍較寬。

2.3.2 pH值對(duì)菌株萘降解率的影響

如圖4所示，菌株的最適生長(zhǎng)pH值為7～7.5，此時(shí)其降解率最高，達(dá)93.5%;在pH值為8時(shí)，萘的降解率為70.2%，相對(duì)pH 7～7.5時(shí)低，但仍高于其在酸性環(huán)境下的降解率，pH 8.5時(shí)，降解率下降到10.3%，降解效應(yīng)極低?？梢钥闯鼍甑膒H值耐受范圍為7～8，耐堿性高于耐酸性。

2.3.3 鹽度對(duì)菌株萘降解率的影響

由圖5可以看出，一定的鹽度可以促進(jìn)菌株的降解效應(yīng)，過高的鹽度會(huì)抑制菌株的生長(zhǎng)，當(dāng)NaCl含量為40 g/L時(shí)，菌株的生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，其萘降解大幅度下降，僅為30.8%。

2.3.4 底物濃度對(duì)菌株萘降解率的影響

如圖6所示，在萘濃度為100 mg/L的培養(yǎng)基中，菌株的降解率最高達(dá)到94%，而后隨著濃度的增加，萘對(duì)于菌株的毒害作用加大，降解率逐漸降低，但在萘濃度為800 mg/L時(shí)，菌株仍表現(xiàn)出一定的降解效應(yīng)，其降解率為15.8%。

2.4 菌株對(duì)不同底物的降解效應(yīng)

由表2可見，菌株在一定濃度的苯酚、甲苯、苯甲酸、1-萘酚、丙酮和辛烷底物環(huán)境中均能達(dá)到一定的生長(zhǎng)量，雖生長(zhǎng)量有限，但表明該菌株具有較廣的底物利用范圍，可以適應(yīng)復(fù)雜的底物環(huán)境。

表2 W1菌株降解不同底物的吸光度值Table 2 Biomass production of strain W1 degradating different substrates

2.5 菌株對(duì)原油組分的降解效應(yīng)

不接菌空白與接菌培養(yǎng)后的原油培養(yǎng)基殘留組分GC-MS分析，以質(zhì)譜譜庫(kù)NIST MS檢索結(jié)果定性，其結(jié)果如圖7所示。原油降解后組分發(fā)生變化，C20～C23、C33～C36組分含量明顯降低，說明該菌株對(duì)該范圍內(nèi)的鏈烴具有較高的降解利用效率。

圖7 不接菌空白及接菌培養(yǎng)基原油的GC-MS圖譜Fig.7 GC-MS of crude oil before and after degradation by stain W1

2.6 菌株降解中間產(chǎn)物的分析

菌株萘降解中間產(chǎn)物的UV-Vis的掃描結(jié)果如圖8所示，降解0 h時(shí)，250～300 nm出現(xiàn)吸收峰，降解12 h以后該吸收峰消失，此處為萘的吸收標(biāo)志峰。隨著降解的進(jìn)行，在20～28 h時(shí)，200～266 nm出現(xiàn)較多吸收峰，為生成的中間產(chǎn)物，312和378 nm處出現(xiàn)2個(gè)標(biāo)志峰，并逐漸增大。36～96 h，312和378 nm處的吸收峰逐漸減小，培養(yǎng)72 h時(shí)，218 nm處出現(xiàn)一個(gè)吸收峰，96 h時(shí)該峰消失。綜上分析，312、378和218 nm處吸收峰所代表的物質(zhì)分別為鄰苯二酚、水楊酸和2-羥基粘康酸半醛［16］。

圖8 萘降解中間產(chǎn)物的UV-Vis掃描圖譜Fig.8 UV-Vis of metabolic intermediates at different degradation stages

3 結(jié)論

從石油污染的土壤中分離得到能夠以萘為唯一碳源生長(zhǎng)的石油降解菌W1，經(jīng)鑒定為沙雷氏菌屬，W1的最適培養(yǎng)條件為35℃，pH為7.5，其生長(zhǎng)溫度范圍較寬，并表現(xiàn)出一定的耐酸耐堿性。特別是W1能耐受30 g/L的鹽度，與其他已報(bào)道萘降解菌相比，有著明顯較高的耐鹽能力。在萘底物濃度為100 mg/L時(shí)，其降解率可達(dá)到94%，雖然隨底物濃度的增加其降解作用逐漸減弱，但在萘濃度800 mg/L時(shí)仍表現(xiàn)出15.8%的降解率。在底物利用方面，該菌在以一定濃度的苯酚、甲苯、苯甲酸、1-萘酚、丙酮、辛烷為底物時(shí)均能表現(xiàn)出一定的、有限的生長(zhǎng)量，具有一定的底物利用廣度。再者，菌株的石油組分利用較廣，GC-MS分析可以看出，W1對(duì)原油中的組分C20～C23、C33～C36的直鏈烴均有較好的降解作用。經(jīng)初步分析，該菌的萘降解過程為一條典型的萘生物降解途徑，萘經(jīng)雙加氧酶催化降解作用，依次生成 1，2-羥基萘，鄰-羥基-順-苯丙酮酸，水楊酸，鄰苯二酚，2-羥基粘康酸半醛，最終進(jìn)入三羧酸循環(huán)(TCA)生成二氧化碳和水［17，18］，最終的降解過程尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，與其他已報(bào)道的萘降解菌相比，菌株W1有著一定的優(yōu)勢(shì)。首先，其生長(zhǎng)溫度范圍較寬，并表現(xiàn)出較廣的耐酸耐堿性，因其為濱海鹽堿地土壤中篩得，有著明顯較高的耐鹽能力，這對(duì)于濱海鹽堿地的石油污染的治理有著特殊的意義。在底物利用方面，該菌亦存在優(yōu)點(diǎn)，其對(duì)原油中的組分C20～C23、C33～C36的直鏈烴均有較好的降解作用，同時(shí)該菌對(duì)多種有機(jī)底物均具有廣泛的降解作用，具有一定的底物利用廣譜性，在治理復(fù)雜有機(jī)污染時(shí)，有著相當(dāng)?shù)膽?yīng)用潛力。因此，對(duì)于該菌的研究為針對(duì)性的鹽堿地石油污染的生物治理提供了實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。

1 Kulik N，Goi A，Trapido M，et al.Degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons by combined chemical pre-oxidation and bioremediation in creosote contaminated soil.J Environ.Manage，2006，78(4):382-391.

2 Wen HY(溫洪宇)，Liao YZ(廖銀章)，Li XD(李旭東).Degradation of Petroleum hydrocarbons by a Pseudomonas sp.HZ-1.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2005，17:628-631.

3 Ding KQ(丁克強(qiáng))，Luo YM(駱永明).Bioremediation of PAHs polluted soil.Soils(土壤)，2001，4:169-178.

4 Zhao X(趙璇)，Tao XQ(陶雪琴)，Lu GN(盧桂寧)，et al.Isolation and characterization of naphthalene-degrading strains.Guangdong Chemical Industry(廣東化工)，2006，33(156):37-39.

5 Song H(宋昊)，Qiu S(邱森)，Zhang J(章儉)，et al.Study on Hydrogenophaga Palleron ii LH J38 a naphthalene degrading strain with high activity.Environ Prot Chem Ind(化工環(huán)保)，2006，26(2):87-90.

6 Cai BL(蔡寶立)，Li YJ(李永軍)，Liang J(梁靖)，et al.I-solation of naphthalene-degrading Pseudomonas sp.ND24 and bioremediation of naphthalene-contaminated soils.J Food Sci Biotechnol(食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào))，2005，24(6):6-9.

7 Li W(李文)，Liao BW(廖寶文).Isolation and identification of naphthalene-degrading strains from mangrove wetland soil.J Anhui Agricul Sci(安徽農(nóng)業(yè)科學(xué))，2011，39:7663-7664.

8 Wang Y(王艷)，Xin JY(辛嘉英)，Song H(宋昊)，et al.Advances in biodegradation of naphthalene.Chin Biotechnol(中國(guó)生物工程雜志)，2009，29(9):119-124.

9 Bosch R，Garcia Valdes E，Moore ER.Genetic characterization and evolutionary implications of a chromosomally encoded naphthalene-degradation upper pathway from Pseudomonas stutzeri AN10.Gene，1999，236:149-157.

10 Chen J(陳靜)，Hu JD(胡俊棟)，Wang XJ(王學(xué)軍)，et al.Desorption of polycyclic aromatic hydrocarbons from soil in presence of surfactants.Chin J Environ Sci(環(huán)境科學(xué))，2006，27:361-365.

11 Dong XZ(東秀珠)，Cai MY(蔡妙英).Common Bacterial I-dentification Manual(常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)).Beijing:Science Publishing House.2001.

12 Huang XL(黃秀梨).Experiment and Guide for Microbiology(微生物學(xué)試驗(yàn)指導(dǎo)).Beijing:Higher Education Publishing House.2003.

13 Li QZ(李慶忠)，Zhang ZZ(張忠智)，Wang HJ(王洪君)，et al.Screening，identification and characteristic of a strain of facultative anaerobe metabolizing diesel.Microbiology(微生物學(xué)通報(bào))，2002，29(3):28-32.

14 Xie DP(謝丹平)，Yin H(尹華)，Peng H(彭輝)，et al.Degradation of crude oil by mixed culture.Chin J Appl Environ Biol(應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào))，2004，10:210-214.

15 Tao XQ，Lu GN，Dang Z，et al.A phenanthrene-degrading strain Sphingomonas sp.GY2B isolated from contaminated soils.Process Biochem，2007，42:401-408.

16 Liu H(劉和)，Wu JY(吳堅(jiān)陽(yáng))，Chen YX(陳英旭).Biodegradation mechanism ofaromaticcompoundsbycomamonas testosteroni ZD4-1 and Pseudomonas aeruginosa ZD4-3.Acta Microbiol Sin(微生物學(xué)報(bào))，2004，44:107-110.

17 Pinyakong O，Habe H，Supaka N，et al..Identification of novel metabolites in the degradation of phenanthrene by Sphingomonas sp.strain P2.FEMS Microbiol.Lett，2000，191:115-121.

18 Xia Y(夏穎).Studies on microbial ecology toxicity of phenanthrene and isolation，characterization of phenanthrene degrader as well as cloning and expression of degrading genes.Hangzhou:Zhejing University(浙江大學(xué))，PhD.2004.