北方五?。▍^(qū)）馬鈴薯晚疫病菌對(duì)甲霜靈和精甲霜靈的敏感性檢測(cè)

王文橋， 王 麗， 韓秀英， 張小風(fēng)， 馬志強(qiáng)， 孟潤杰

（河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所，河北省農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治工程技術(shù)研究中心，保定 071000）

馬鈴薯晚疫病具有暴發(fā)性和毀滅性，對(duì)馬鈴薯生產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重威脅，生產(chǎn)上主要依靠藥劑防治。甲霜靈、精甲霜靈、噁霜靈等苯基酰胺類殺菌劑對(duì)卵菌菌絲生長、休止孢萌發(fā)均具有很強(qiáng)的抑制作用，有良好的內(nèi)吸傳導(dǎo)性能，對(duì)晚疫病有優(yōu)異的預(yù)防、治療和鏟除作用，甲霜靈單劑及甲霜靈、精甲霜靈、噁霜靈等苯基酰胺類殺菌劑與代森錳鋅的混劑是防治晚疫病最有代表性的藥劑，曾大大提高晚疫病等卵菌病害的防治水平，該類藥劑在國內(nèi)外使用年限長約30年，用于種薯處理或葉面噴施。據(jù)作者調(diào)查，近幾年來甲霜靈·錳鋅、精甲霜靈·錳鋅等混劑對(duì)我國馬鈴薯晚疫病防效有所下降。國內(nèi)外相繼報(bào)道了馬鈴薯晚疫病菌對(duì)甲霜靈或精甲霜靈抗性發(fā)生［1－14］，生產(chǎn)中迫切需要檢測(cè)馬鈴薯晚疫病菌（Phytophthora infestans）對(duì)甲霜靈和精甲霜靈的敏感性，以驗(yàn)證田間藥效下降是否由于馬鈴薯晚疫病菌對(duì)甲霜靈和精甲霜靈敏感性降低而造成。河北、吉林、遼寧、黑龍江和內(nèi)蒙古是我國商品薯主產(chǎn)區(qū)，也是我國重要的種薯繁育基地。本研究檢測(cè)了2007－2009年從河北、吉林、遼寧、黑龍江和內(nèi)蒙古等北方主產(chǎn)區(qū)采集的馬鈴薯晚疫病菌對(duì)甲霜靈、精甲霜靈的敏感性，旨在明確上述北方五?。▍^(qū)）馬鈴薯晚疫病菌對(duì)甲霜靈和精甲霜靈的敏感性差異及抗性發(fā)生狀況，為制定苯基酰胺類殺菌劑使用對(duì)策及指導(dǎo)馬鈴薯晚疫病化學(xué)防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試藥劑

氨芐青霉素（ampicillin），中諾藥業(yè)（石家莊）有限公司；利福平（rifampicin），沈陽紅旗制藥有限公司；95%五氯硝基苯（quintozene）原藥，山西三立化工有限公司；97%甲霜靈（metalaxyl）原藥，沈陽化工研究院；97.1%精甲霜靈（metalaxyl－M）原藥，先正達(dá)（中國）投資有限公司；二甲亞砜（DMSO，分析純），天津市福晨化學(xué)試劑廠；丙酮（acetone，分析純），天津市嘉順化工有限公司。

1.2 供試培養(yǎng)基

黑麥瓊脂蔗糖培養(yǎng)基（RSA）：黑麥60g，蔗糖20g，瓊脂粉12g，蒸餾水1000mL。

胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基（CA）：胡蘿卜200g榨成汁，瓊脂粉20g，蒸餾水1000mL。

選擇性培養(yǎng)基：含氨卞青霉素200μg／mL，利福平20μg／mL和五氯硝基苯100μg／mL的RSA培養(yǎng)基。

1.3 供試菌株

2007－2009年從河北省、吉林省、遼寧省、黑龍江省和內(nèi)蒙古自治區(qū)種植馬鈴薯的田塊采集晚疫病病葉，經(jīng)分離純化鑒定后獲得的晚疫病菌菌株10℃保存于試管中RSA斜面上。所有菌株均來自相距1km以上的田塊。

1.4 供試植物材料

在溫室種植感病種薯‘費(fèi)烏瑞它（favorita）’，待長至7～8片復(fù)葉時(shí)剪取中上部展開葉片供試。

1.5 馬鈴薯晚疫病菌對(duì)甲霜靈及精甲霜靈的敏感性檢測(cè)

1.5.1 菌絲生長速率法檢測(cè)馬鈴薯晚疫病菌對(duì)甲霜靈的敏感性

將甲霜靈原藥用二甲亞砜配制成1000μg／mL的母液，再稀釋至50μg／mL，按體積比1∶9將藥液與三角瓶中融化后冷卻至約60℃的CA培養(yǎng)基充分混勻，配制成含甲霜靈（5、100μg／mL）的CA 平板，以僅含二甲亞砜的CA平板為對(duì)照。將在RSA平板上培養(yǎng)10d的菌株用打孔器沿菌落邊緣打取直徑為5mm的菌餅，接種在含5、100μg／mL甲霜靈CA平板及對(duì)照平板中央，每處理接種3皿，18℃培養(yǎng)7～10d，當(dāng)對(duì)照菌落直徑達(dá)到3cm以上時(shí)，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

參照Oyarzun的方法［15］將菌株劃分成：抗性菌株（R），在含5μg／mL和100μg／mL甲霜靈的CA平板上菌落直徑均≥對(duì)照菌落直徑的40%；敏感菌株（S），在含5μg／mL和100μg／mL甲霜靈的CA平板上菌落直徑均＜對(duì)照菌落直徑的40%；中間型菌株（I），在含5μg／mL甲霜靈的CA平板上菌落直徑≥對(duì)照菌落直徑的40%，在含100μg／mL甲霜靈的CA平板上菌落直徑＜對(duì)照菌落直徑的40%。

抗性菌株分布頻率（%）＝（抗性菌株數(shù)／菌株總數(shù)）×100。

1.5.2 葉盤漂浮法［16］檢測(cè)馬鈴薯晚疫病菌對(duì)甲霜靈及精甲霜靈的敏感性

將甲霜靈及精甲霜靈原藥先用少量丙酮溶解，再用去離子水稀釋成1000μg／mL的母液，用去離子水稀釋配成系列濃度的藥液：200、100、50、10、5、1、0.5、0.1、0.05μg／mL。每個(gè)濃度的藥液取20mL，加入直徑9cm的培養(yǎng)皿中，對(duì)照加蒸餾水，每處理3皿。剪取長勢(shì)一致的馬鈴薯葉片，用打孔器打取直徑為15mm的葉盤，背面向上漂浮于液面上，每皿10片葉盤。將菌株在RSA平板上培養(yǎng)7～10d后，用蒸餾水將孢子囊洗下，配制成濃度為1×105孢子囊／mL的孢子囊懸浮液，用微型移液器接種于葉盤中心，10μL／葉盤。置于18～20℃、每天16h光照條件下培養(yǎng)4～5d，根據(jù)葉盤上產(chǎn)孢面積占葉盤面積的百分比調(diào)查葉盤病級(jí)：0級(jí)，無?。?級(jí)，1%～5%；3級(jí)，6%～10%；5級(jí)，11%～20%；7級(jí)，21%～50%；9級(jí)，＞50%。

計(jì)算病情指數(shù)及相對(duì)防效。利用DPS數(shù)據(jù)處理軟件，根據(jù)藥劑系列濃度的對(duì)數(shù)值與每個(gè)濃度相對(duì)防效的幾率值之間的線性回歸分析，求出甲霜靈及精甲霜靈對(duì)菌株的毒力回歸方程式（Y＝a＋bX）、相關(guān)系數(shù)（R）及菌株對(duì)甲霜靈及精甲霜靈敏感性（EC50值），參照Schwinn［16］等的方法劃分菌株：敏感（sensitive，S），EC50值≤0.01μg／mL；中間型（inter－mediate，I），0.01μg／mL＜EC50值≤10μg／mL；抗性（resistant，R），EC50值＞10μg／mL。計(jì)算北方五省馬鈴薯晚疫病菌對(duì)甲霜靈及精甲霜靈的各類敏感型菌株所占比率。

病情指數(shù)＝∑（每個(gè)級(jí)別的葉盤數(shù)×相應(yīng)病級(jí)數(shù)）×100／（葉盤總數(shù)×最高病級(jí)數(shù)）；

相對(duì)防效（%）＝［（對(duì)照病情指數(shù)－處理病情指數(shù)）／對(duì)照病情指數(shù)］×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 在離體條件下馬鈴薯晚疫病菌對(duì)甲霜靈的敏感性

菌絲生長速率法檢測(cè)結(jié)果顯示，河北、遼寧、吉林、黑龍江及內(nèi)蒙古等北方五?。▍^(qū) ）馬鈴薯晚疫病菌已普遍對(duì)甲霜靈產(chǎn)生抗性。供試的380個(gè)菌株中，對(duì)甲霜靈的抗性菌株頻率達(dá)到80.0%，表明抗性菌株已在群體中占優(yōu)勢(shì)，中間型菌株占2.9%，而敏感菌株占17.1%（表1）。采自河北省的菌株中對(duì)甲霜靈的抗性菌株從2007年的100%降為2008年的66.4%，2009年又回升至74.2%。而采自黑龍江的菌株中對(duì)甲霜靈的抗性菌株頻率從2007年的52.9%上升為2008－2009年的100%。采自吉林省的菌株中對(duì)甲霜靈的抗性菌株頻率從2008年的63.0%上升為2009年的90.7%。2008年采自遼寧和內(nèi)蒙古的菌株中對(duì)甲霜靈的抗性菌株分別占100%和81.8%。

表1 菌絲生長速率法檢測(cè)380株馬鈴薯晚疫病菌對(duì)甲霜靈的敏感性

2.2 在活體條件下馬鈴薯晚疫病菌對(duì)甲霜靈的敏感性

采用FAO推薦的葉盤漂浮法檢測(cè)了采自河北、遼寧、吉林、黑龍江及內(nèi)蒙古的380個(gè)菌株中222株對(duì)甲霜靈的敏感性，結(jié)果表明，其EC50值分布在0.0284～815.3618μg／mL之間，平均值為106.29μg／mL，對(duì)甲霜靈的抗性菌株占73.5%，與菌落生長速率法所測(cè)對(duì)甲霜靈的抗性菌株頻率（80%）較為一致，中間型菌株占26.5%（表2），明顯高于菌落生長速率法所測(cè)得的中間型菌株頻率（2.9%），未檢測(cè)到敏感菌株，而用菌落生長速率法測(cè)得的敏感菌株頻率為17.1%。葉盤漂浮法檢測(cè)的河北省抗性菌株出現(xiàn)頻率由2007年的100%降為2008年的30.4%，2009年又回升至68.8%。吉林省的抗性菌株頻率從2008年的69.34%升為2009年的96.2%。黑龍江的抗性菌株頻率從2008年的73.3%升至2009年的100%。

表2 葉盤漂浮法檢測(cè)222株馬鈴薯晚疫病菌對(duì)甲霜靈的敏感性1）

2.3 活體條件下馬鈴薯晚疫病菌對(duì)精甲霜靈的抗性

如表3所示，葉盤漂浮法測(cè)得采自黑龍江、遼寧、吉林、河北和內(nèi)蒙古五?。▍^(qū)）的95株馬鈴薯晚疫病菌對(duì)精甲霜靈的EC50值分布在0.0029～211.1808μg／mL之間，平均值為29.72μg／mL，抗性菌株占54.5%，中間型菌株占44.5%，敏感菌株僅占1.0%，而對(duì)甲霜靈的EC50值分布在0.0284～489.0352μg／mL之間，平均值為52.37μg／mL，抗性菌株占64.2%，中間型菌株占35.8%，未發(fā)現(xiàn)敏感菌株，表明馬鈴薯晚疫病菌對(duì)精甲霜靈和甲霜靈均已普遍產(chǎn)生抗性。所測(cè)的95個(gè)菌株中，對(duì)精甲霜靈和甲霜靈的抗性菌株出現(xiàn)頻率基本一致，對(duì)精甲霜靈的抗性菌株出現(xiàn)頻率略低于對(duì)甲霜靈的抗性菌株出現(xiàn)頻率。各地區(qū)對(duì)精甲霜靈的抗性菌株或中間型菌株分布頻率差異較大，采自河北省的40株中，中間型菌株占優(yōu)勢(shì)（62.5%），抗性菌株僅占34.9%，而其他4省采集的55株中，抗性菌株占優(yōu)勢(shì)（69.1%），中間型菌株占30.9%。

表3 葉盤漂浮法檢測(cè)馬鈴薯晚疫病菌對(duì)精甲霜靈和甲霜靈的敏感性比較1）

3 討論

20世紀(jì)80年代以來，甲霜靈及其有效光學(xué)異構(gòu)體精甲霜靈、噁霜靈等苯基酰胺類藥劑相繼被普遍用于馬鈴薯晚疫病防治。本研究采用菌絲生長速率法和葉盤漂浮法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)河北、遼寧、吉林、黑龍江和內(nèi)蒙古等北方五?。▍^(qū)）馬鈴薯晚疫病菌對(duì)甲霜靈的抗性菌株分布頻率分別為80%和73.5%，以葉盤漂浮法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)對(duì)精甲霜靈的抗性菌株分布頻率達(dá)54.5%，表明上述五?。▍^(qū)）馬鈴薯晚疫病菌對(duì)甲霜靈及精甲霜靈已普遍產(chǎn)生抗性，甲霜靈（或精甲霜靈）與代森錳鋅的混劑對(duì)晚疫病的防效勢(shì)必降低，但實(shí)際防效受到多大影響，能否繼續(xù)使用，尚需進(jìn)一步調(diào)查。國外已有研究表明，幾年內(nèi)停止使用苯基酰胺類藥劑或啟用其混劑，可使抗性頻率明顯下降［17］，因此，在上述北方五?。▍^(qū)）應(yīng)停止使用甲霜靈單劑，慎用甲霜靈（或精甲霜靈）混劑，葉面噴施時(shí)適當(dāng)提高甲霜靈（或精甲霜靈）混劑的濃度。此外，還應(yīng)注意到甲霜靈與其他苯基酰胺類藥劑作用機(jī)理相同［18］，它們之間存在著正交互抗性關(guān)系，應(yīng)限制噁霜靈等其他苯基酰胺類藥劑在對(duì)甲霜靈或精甲霜靈普遍產(chǎn)生抗性的地區(qū)使用，優(yōu)先選用作用機(jī)理不同的藥劑（烯酰嗎啉、雙炔酰菌胺、嘧菌酯、氟吡菌胺·霜霉威、烯酰嗎啉·錳鋅、霜脲氰·錳鋅等）。

我國各地馬鈴薯晚疫病化學(xué)防治受到不同程度的重視，用藥狀況差異很大，晚疫病菌對(duì)甲霜靈或精甲霜靈的抗性發(fā)生狀況可能存在很大差異，需要擴(kuò)大抗藥性檢測(cè)范圍，使抗藥性監(jiān)測(cè)常態(tài)化，根據(jù)抗藥性發(fā)生狀況或抗藥性菌株分布情況進(jìn)行藥劑選用。在很少用藥防治的偏僻、干旱、山地及散種地區(qū)，馬鈴薯晚疫病菌群體中對(duì)甲霜靈或精甲霜靈的抗性菌株的分布頻率可能很低，可選用苯基酰胺類藥劑及其混劑，但為了延緩抗藥性產(chǎn)生，應(yīng)提倡將該類藥劑與其他不同作用機(jī)理的藥劑交替或混合噴施。在種薯和規(guī)?；唐肥砘兀總€(gè)生長季節(jié)施藥次數(shù)可達(dá)6～10次，可能分布著很高比率的抗性菌株，因此，應(yīng)盡量選用作用機(jī)理不同的藥劑，減少或暫時(shí)停用苯基酰胺類殺菌劑（包括混劑），待晚疫病菌對(duì)該類藥劑恢復(fù)至最初的敏感狀態(tài)時(shí)再恢復(fù)使用。

本研究發(fā)現(xiàn)葉盤漂浮法檢測(cè)的北方五省（區(qū)）95株馬鈴薯晚疫病菌中，54.5%的菌株為對(duì)精甲霜靈的抗性菌株，明顯低于秘魯?shù)膶?duì)精甲霜靈的抗性菌株分布頻率（100%）［19］。2007－2009年采自河北省和黑龍江省的馬鈴薯晚疫病菌對(duì)精甲霜靈的抗性頻率分別為34.9%和61.5%，明顯高于沈江衛(wèi)等報(bào)道的2006－2007年河北、黑龍江的抗性頻率（8.9%）［14］。2007－2009年采自河北圍場(chǎng)、崇禮等壩上地區(qū)的117株馬鈴薯晚疫病菌中，對(duì)甲霜靈的抗性菌株頻率為59.8%，明顯高于王文橋等2002年報(bào)道的1997－1999年采自河北圍場(chǎng)縣和崇禮縣的217株馬鈴薯晚疫病菌中對(duì)甲霜靈的抗性菌株所占頻率（29%）［20］。表明河北省和黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌對(duì)精甲霜靈及甲霜靈的抗性菌株所占頻率呈上升趨勢(shì)，這是由于含甲霜靈、精甲霜靈或噁霜靈的藥劑使用范圍擴(kuò)大、使用次數(shù)增多和用量增大造成，還是由于不同地塊不同的供試菌株具有不同敏感性造成，有待研究查明。

對(duì)甲霜靈的抗性頻率在不同地區(qū)及不同年份之間存在較大差異，黑龍江和吉林等地的抗性頻率明顯高于河北、遼寧和內(nèi)蒙古的抗性頻率，這種抗性頻率地區(qū)差異及年度波動(dòng)可能與各地區(qū)及相同地區(qū)不同年份甲霜靈及其相關(guān)藥劑使用情況不同有關(guān)，也可能是取樣點(diǎn)不同造成的，原因有待查明。有些地區(qū)抗性頻率已高達(dá)100%，與國內(nèi)其他報(bào)道的結(jié)果一致［7－14］。

本研究采用菌絲生長速率法和葉盤漂浮法檢測(cè)的馬鈴薯晚疫病菌對(duì)甲霜靈的抗性菌株分布頻率基本一致（分別為80%和73.5%），而檢測(cè)低抗菌株和敏感菌株的分布頻率時(shí)結(jié)果差別很大，前者檢測(cè)的中間型菌株的分布頻率為2.9%，明顯低于后者檢測(cè)的中間型菌株分布頻率（26.5%），而前者檢測(cè)的敏感菌株分布頻率（17.1%）明顯高于后者檢測(cè)的敏感菌株分布頻率（0），這種差異可能起因于劃分菌株類型（抗性、中間型及敏感）的標(biāo)準(zhǔn)不同。

任何生測(cè)方法均有其適用性。防治卵菌病害的藥劑有些主要是抑制病菌菌絲生長，另一些（如QoI類、接觸性殺菌劑）主要表現(xiàn)為抑制孢子萌發(fā)；一部分藥劑具有內(nèi)吸傳導(dǎo)性，另一部分藥劑為非內(nèi)吸劑，因此，要根據(jù)藥劑的作用特點(diǎn)及內(nèi)吸傳導(dǎo)性確定適合的抗藥性檢測(cè)方法。菌絲生長速率法適合于檢測(cè)各類能在離體條件下培養(yǎng)的植物病原菌對(duì)能明顯抑制菌絲生長殺菌劑的敏感性，目前被廣泛應(yīng)用，國內(nèi)外有人用該法檢測(cè)馬鈴薯晚疫病菌對(duì)甲霜靈、精甲霜靈、CAA類藥劑（烯酰嗎啉）、霜脲氰、百菌清的敏感性［15］，該法不適合檢測(cè)對(duì)非內(nèi)吸性藥劑及非內(nèi)吸性藥劑與內(nèi)吸性藥劑混劑的敏感性。而FAO 1982年推薦的葉盤漂浮法僅適合于檢測(cè)馬鈴薯晚疫病菌對(duì)有良好跨層傳導(dǎo)性藥劑（如甲霜靈）的敏感性［16］，國內(nèi)被用于檢測(cè)黃瓜或葡萄霜霉病菌、馬鈴薯或番茄晚疫病菌對(duì)內(nèi)吸性藥劑的敏感性［20－21］，該法不適合檢測(cè)對(duì)混劑及非內(nèi)吸性藥劑的敏感性，因而使用范圍較窄。為了擴(kuò)大適用檢測(cè)藥劑范圍，可采用葉盤法，即以藥液噴霧處理葉盤，以噴霧孢子囊懸浮液接種葉盤，檢測(cè)馬鈴薯晚疫病菌對(duì)苯基酰胺類藥劑噁霜靈及其他類型藥劑的敏感性［22］。也可采用葉盤 微 量 滴 定 板 法 （leaf segment microtiter plate test）［23］，以噴霧施藥及噴霧孢子囊接種的方法處理置于24孔微量滴定板孔中2%瓊脂培養(yǎng)基上的葉盤，檢測(cè)馬鈴薯晚疫病菌或葡萄霜霉病菌對(duì)所有防治卵菌病害藥劑的敏感性。

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