新孢子蟲SRS2基因的克隆及原核表達

邢小勇，王 權(quán)，溫峰琴，郝寶成，項海濤，胡永浩

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅蘭州 730050）

新孢子蟲病是由新孢子蟲（Neospora caninum）引起的一種主要危害犬和奶牛的原蟲病。本病主要引起孕畜流產(chǎn)、死胎以及新生畜運動障礙和神經(jīng)系統(tǒng)疾病病[1]。新孢子蟲病在世界上主要奶牛養(yǎng)殖大國廣泛流行，美國加利福尼亞州奶牛新孢子蟲病造成的直接經(jīng)濟損失每年達3500萬美元，每年給澳大利亞肉牛、奶牛業(yè)造成的損失達1億多美元；在美國、英國、韓國分別有42.5%、12.5%、19.5%的牛流產(chǎn)是由新孢子蟲病引起的[2-4]；我國臺灣地區(qū)牛血清中新孢子蟲抗體陽性率高達44.9%[5]。因此，新孢子蟲病被認為是世界上奶牛產(chǎn)業(yè)國家奶牛流產(chǎn)的主要原因之一。有效控制該病主要依靠疫苗接預(yù)防和淘汰陽性奶牛。目前用于診斷和制造疫苗的新孢子蟲蛋白主要集中在幾種表面蛋白和致密顆?？乖?，如NcSRS2、NcSAG1、NcDG1、NcDG2和NcGRA2等。NcSRS2（Nc-p43）是新孢子蟲的主要表面蛋白之一。NcSRS2在速殖子和緩殖子階段均能表達，NcSRS2基因的ORF為1206 bp，編碼401個氨基酸，表達的蛋白分子量為43kDa，并且在其N端含有53個氨基酸大小的信號肽。其作用是介導(dǎo)蟲體入侵宿主細胞，抗NcSRS2的單克隆抗體能阻斷這一作用。NcSRS2基因已經(jīng)成功在昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)中得到表達，并且證實NcSRS2是一種含有糖基磷脂酰肌醇錨的跨膜蛋白，可用做診斷和疫苗的免疫原[6]。本實驗擬通過克隆NcSRS2基因的部分片段，并進行原核蛋白表達，為制備新孢子蟲亞單位疫苗和診斷試劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體 pMD19-T克隆載體購自寶生物（大連）工程有限公司；pET-32a表達載體由本實驗室保存；大腸桿菌DH5α、BL21菌種由本實驗室保存。

1.1.2 主要生化試劑及工具酶 TaqMix購于廣州東盛生物科技有限公司；T4DNA連接酶、EcoRⅠ、XhoⅠ購自寶生物（大連）工程有限公司；DNA凝膠回收試劑盒為美國AXYGEN產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 DNA模板提取 取蛋白酶K消化液滴加到含有新孢子蟲蟲體的新孢子蟲熒光抗體檢測試劑盒的玻板上，水浴過夜。利用基因組提取試劑盒從消化液中提取新孢子蟲DNA，置-70 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 NcSRS2序列分析與引物設(shè)計 利用DNAStar5.0軟件對GeneBank中發(fā)表的NcSRS2基因序列（登錄號AY940488）進行抗原性和疏水性等分析。根據(jù)GeneBank中登陸的NcSRS2序列（登錄號AY940488），用本地引物設(shè)計軟件Primer Premier5.0在163-1141 bp上設(shè)計上下游引物，并在引物兩端分別加上EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點（下劃線表示酶切位點）。上游引物：5‘AATGAATTCCCGTTCAAGTCGGAA‘3；下游引物：5‘TTACTCGAGCGTCACATGCATCTCC‘3，引物由美國Invitrogen英杰生命技術(shù)有限公司合成。

1.2.3 目的基因體外擴增與TA克隆 PCR反應(yīng)程序為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。將純化片段與PMD19-T載體相連，獲得重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒pMD19T-dNcSRS2t。對提取的質(zhì)粒分別進行PCR及雙酶切鑒定。

1.2.4 目的基因重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建 提取pMD19TNcSRS2t和pET-32a質(zhì)粒，用EcoRⅠ和XhoⅠ進行雙酶切，37 ℃酶切3 h后，1%瓊脂糖電泳分析酶切結(jié)果并回收酶切產(chǎn)物。將回收的酶切目的基因與載體DNA的進行連接與轉(zhuǎn)化。提取質(zhì)粒，酶切鑒定正確后，陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21，并進行PCR和酶切鑒定。

1.2.5 蛋白誘導(dǎo)表達與純化 將轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中，選擇IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度和時間等因素進行蛋白表達條件的優(yōu)化。在IPTG至終濃度為1mM、37 ℃誘導(dǎo)6 h時蛋白表達量最高，按此條件大量誘導(dǎo)菌體收集菌液，離心收集，冰浴超聲至懸浮液透明，使菌體裂解，同時制備包涵體和上清。進行表達產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。

1.2.6 表達蛋白的Western-blot分析 采用半干轉(zhuǎn)印法，對誘導(dǎo)表達目的產(chǎn)物進行免疫轉(zhuǎn)印。取出NC膜，用PBS緩沖液洗10 min，然后置于盛有10mL的封閉液中（含5%脫脂奶的pH7.6的PBST緩沖液）的平皿中，室溫下過夜。封閉結(jié)束后，用PBST冼NC膜3次，然后將其放入10 mL（其中含有5%脫脂奶）用PBST 1:200倍稀釋的?？剐骆咦酉x陽性血清中，室溫緩慢搖動2 h；然后用PBST漂洗濾膜3次，每次10～15 min。洗畢，將膜放入PBST（含有5%脫脂奶）1:2000倍稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗牛IgG（酶標(biāo)二抗），室溫下輕搖孵育2 h，取出用PBST沖洗4次，每次間隔5 min，最后用PBS緩沖液沖洗10 min。然后將漂洗后NC膜轉(zhuǎn)移到DAB顯色液中，室溫避光輕搖2～10 min觀察顯色情況，等抗原區(qū)出現(xiàn)明顯褐色條帶時取出，并用去離子水洗滌，終止反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的擴增與鑒定

用設(shè)計的上下游引物對NcSRS2基因進行擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果表明在998 bp處有一清晰的帶（圖1），大小與預(yù)期結(jié)果相符，說明引物設(shè)計合理，PCR條件正確。

2.3 重組質(zhì)粒PMD19T-NcSRS2的PCR鑒定

PCR產(chǎn)物與PMD19T載體進行重組連接后轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細胞，經(jīng)過藍白斑篩選重組的轉(zhuǎn)化體。挑選白色菌落分別接種于5 mL的含AMP的LB培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，以提取質(zhì)粒為模板，進行PCR檢測，結(jié)果擴出998 bp大小的片段（圖2），與預(yù)期結(jié)果相符。

2.4 重組質(zhì)粒PMD19T-NcSRS2的酶切鑒定

對獲得重組質(zhì)粒PMD19T-NcSRS2進行酶切鑒定，切出了998 bp和2692 bp大小片段（圖3），與預(yù)期相符。

2.5 重組質(zhì)粒pET32a-NcSRS2t的PCR鑒定

用EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切pMD19T-NcSRS2t重組載體與pET32a載體，分別回收NcSRS2t和雙酶切后的pET32a載體，連接轉(zhuǎn)化后，挑選菌落分別接種于5 mL的含AMP的LB培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，以提取質(zhì)粒為模板，進行PCR檢測，結(jié)果擴出998 bp大小的片段（圖4），與預(yù)期結(jié)果相符。

2.6 重組質(zhì)粒pET32a-NcSRS2t的酶切鑒定

對獲得重組質(zhì)粒進行酶切鑒定，切出了998 bp和5866 bp大小片段（圖5），與預(yù)期相符。

2.7 重組蛋白的純化與Western blotting分析

應(yīng)用12%的SDS-PAGE對純化前和純化后的蛋白進行比較，純化后的雜蛋白較少，表明純化效果較理想。M為普通蛋白Marker，1為純化前的蛋白，2為純化后的蛋白。對NcSRS2t基因表達載體的工程菌株的重組蛋白進行Western blotting檢測，發(fā)現(xiàn)在相對分子量約為53.1KD處有一特異條帶（圖6），表明此表達產(chǎn)物含有能與新孢子蟲陽性血清反應(yīng)的抗原表位。

3 討論與分析

3.1 NcSRS2基因包含一個由1203個核酸組成的開放閱讀框，編碼一個由401個氨基酸組成的蛋白，該蛋白包含有一個53個氨基酸的信號肽。研究表明NcSRS2表面蛋白主要在速殖子和緩殖子階段表達，表達的蛋白在介導(dǎo)寄生蟲的粘附和入侵過程中起主要的作用。Hemphilld等證實新孢子入侵宿主細胞是一個受體-配體結(jié)合模式的過程，而且該過程是以蛋白-蛋白而不是蛋白-糖類物質(zhì)的結(jié)合模式進行[7]。NcSRS2是新孢子蟲主要的表面蛋白之一，很多實驗證明NcSRS2在診斷和預(yù)防方面意義重大。

3.2 本實驗應(yīng)用DNAstar 等分子生物學(xué)軟件氨基酸序列中稀有密碼子情況，發(fā)現(xiàn)NcSRS2編碼的氨基酸序列中含有一定的稀有密碼子，特別是第6、9、16、21位和25、26位連續(xù)出現(xiàn)稀有密碼子，這對蛋白的表達是非常不利得。Eui-Sun SON等以GST融合的形式分別表達了NcSRS2全長，去除N端信號肽和C端疏水區(qū)域，去除N端信號肽和C端疏水區(qū)域后靠近N端的2/3部分、全長C端的2/3部分、全長N端的1/3部分、全長中間1/3部分和全長C端的1/3部分，結(jié)果表明NcSRS2的主要抗原位點在靠近C端的2/3處[8]。而且考慮到N端還是C端都有疏水區(qū)和稀有密碼子的情況，決定去除N端和C端的疏水序列改用融合蛋白表達載體，在不影響抗原性的前提下實現(xiàn)高效表達。本實驗成功地構(gòu)建了PET-32a-SRS2基因的原核表達載體，經(jīng)測序分析表明，所構(gòu)建的載體含SRS2的163-1141基因片段。該載體能在大腸桿菌BL21中高效表達，表達產(chǎn)物大部分以上清形式存在，經(jīng)純化后，雜條帶很少，純化效果很好，可以用作下一步實驗。純化后的產(chǎn)物通過Western blotting 檢測，結(jié)果表明表達的產(chǎn)物可以和天然的抗新孢子蟲牛陽性血清反應(yīng)，說明該表達產(chǎn)物具有很好的反應(yīng)原性，可以用來作為良好的診斷抗原。

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