高壓靜電抗溶劑法制備聚乳酸微球

陳愛政，楊月梅，王士斌，孫晴晴，劉源崗，黨婷婷

（1華僑大學化工學院，福建 廈門 361021；2華僑大學生物材料與組織工程研究所，福建 廈門 361021）

高壓靜電抗溶劑法制備聚乳酸微球

陳愛政1，2，楊月梅1，王士斌1，2，孫晴晴1，劉源崗1，2，黨婷婷1

（1華僑大學化工學院，福建 廈門 361021；2華僑大學生物材料與組織工程研究所，福建 廈門 361021）

以無水乙醇為非溶劑，采用高壓靜電抗溶劑法制備聚乳酸微球。通過 24全因子試驗設計對微球粒徑和粒徑分布的影響因素進行了顯著性分析。并考察最顯著因素對微球表面形貌的影響規(guī)律。結(jié)果表明，推進速度是影響微球粒徑的最顯著因素，最優(yōu)條件下微球表面光滑、球形度好，粒徑分布窄。濃度為3%，相對分子質(zhì)量為5萬～10萬的聚乳酸制備的微球，球形度較好。經(jīng)過高壓靜電處理后，傅里葉紅外光譜測定表明聚乳酸無明顯結(jié)構(gòu)攝動；X射線粉末衍射分析表明聚乳酸晶體結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯變化。

高壓靜電體系；抗溶劑；聚乳酸；因子試驗

隨著高分子材料科學和現(xiàn)代醫(yī)藥學的相互滲透，選擇合適的高分子材料作為藥物控制釋放載體，進行制備具有生物相容性良好、可生物降解性和緩釋性的藥物載體已成為最熱門的研究方向之一[1-3]。聚乳酸[Poly(lactic acid)，PLA]及其共聚物在人體內(nèi)的代謝是通過水解或酶解最終完全分解為 CO2和H2O，中間產(chǎn)物乳酸也是體內(nèi)正常糖代謝的產(chǎn)物；且人體對此類材料有很強的耐受性，故成為人們廣泛關注的藥物緩釋高分子材料。自 1970年 Yolles等率先將 PLA用作藥物長效釋放劑載體，1979年Beck以聚乳酸-羥基乙酸（PLGA）為囊材制備出孕酮PLGA緩釋膠囊以來[4]，PLA及其共聚物已被用作一些半衰期短、穩(wěn)定性差、易降解及毒副作用大的藥物控釋載體，如抗生素、抗癌用藥、疫苗、激素、計生用藥、解熱鎮(zhèn)痛藥以及神經(jīng)系統(tǒng)用藥等，可有效地增加給藥途徑，減少給藥次數(shù)和給藥量，提高藥物生物利用度，減少其對肝、腎等的副作用。

目前，制備聚乳酸微球的傳統(tǒng)方法中，乳化-溶劑揮發(fā)法、復乳法、聚合法等存在產(chǎn)品易于聚集、融合，分離純化困難，需花大量時間和精力去除殘留溶劑、多余藥物和不可降解的添加物（如作為穩(wěn)定劑的聚乙烯醇），不適宜工業(yè)化生產(chǎn)；噴霧干燥法、熔融法、鹽析法等制備過程比較激烈，如溫度較高或pH值變化較大，對藥物的穩(wěn)定性有較高的要求，因此，不適合裝載多肽、蛋白類大分子藥物或其它熱敏性物質(zhì)。

靜電噴射是利用靜電力將液體流破裂為帶電液滴的技術。在過去的幾十年里，該技術已廣泛應用在燃料噴霧、噴墨印刷和細胞固定等領域。高分子溶液、乳液，以及固體粒子懸浮液都可用靜電噴射，并且對水溶性和非水溶性高分子都適用[5-7]。該工藝簡便高效、條件溫和，且具有控制微粒的形狀、表面形貌及粒徑大小等優(yōu)良特性[8-10]，特別是其制備的微粒具有高度穩(wěn)定的單分散性，其釋放行為往往能被更準確控制。另外，本文引入一種抗溶劑的概念。當溶解于有機溶劑的聚合物溶液泵入非溶劑體系中，兩者快速接觸，可提高聚合物的飽和度，繼而迅速沉析、固化形成聚合物微球[11]。

鑒于靜電噴射在制備聚乳酸微球的獨特優(yōu)勢，借助高壓微膠囊成型裝置，引進抗溶劑概念，本研究采用高壓靜電抗溶劑法制備聚乳酸微球。通過Minitab 軟件設計全因子試驗確定微球制備工藝參數(shù)中具有顯著影響的因素，并考察顯著因素對微球形貌、粒徑的影響。在考察的操作條件下，研究了不同聚乳酸分子量/濃度對微球形貌及粒徑分布的影響。最后，用FTIR、XRPD對制備前后聚乳酸的結(jié)構(gòu)變化進行表征。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

L-聚乳酸（PLLA，Mw分別為1.1萬，3萬，5萬，7.6萬，10萬，濟南岱罡生物工程有限公司）；乙醇和二氯甲烷均為分析純，購自國藥集團。

高壓微膠囊成型裝置（自制）；AJ5805微量注射泵（上海安吉電子設備有限公司）；BS210S電子分析天平（德國 Sartorius）；FDU-2100 冷凍干燥儀（日本東京理化器械株式會社）；TGL-18M臺式高速冷凍離心機（湖南凱達科學儀器有限公司）；S-4800掃描電子顯微鏡（日本Hitachi）；X射線衍射儀（荷蘭帕納科公司）；FTIR 8400S傅里葉變換紅外光譜儀（日本Shimadzu）。

1.2 聚乳酸微球的制備

高壓靜電抗溶劑過程如圖1所示。高壓靜電裝置的輸出電壓為0～10 kV，微量注射泵推進速度為1～99 mm/h。高壓發(fā)生器的正極接注射器針頭，負極接大口徑鐵制容器。容器內(nèi)裝大體積的無水乙醇，注射器內(nèi)裝聚乳酸溶液。輸液泵以一定的速度向下推壓聚乳酸溶液，在電場力的作用下，聚乳酸溶液克服黏滯力和表面張力，呈一定粒徑的液滴。電噴產(chǎn)生的液滴垂直滴入到接收容器中，沉析固化形成聚乳酸微球。離心收集樣品，冷凍干燥。

高壓靜電抗溶劑法的過程基本同靜電噴射法，不同之處在于無水乙醇代替接收鋁板，吸收溶解溶液中的有機溶劑，使噴出液滴中的溶劑急速膨脹，從而使聚乳酸過飽和，有助于加快聚乳酸微球的固化且收集方便、不易粘連。

圖1 高壓靜電抗溶劑過程

1.3 實驗設計

影響靜電噴射產(chǎn)生的聚合物微粒形態(tài)/粒徑的因素有：電壓、聚合物分子量、濃度、流速、溶劑類型、針頭內(nèi)徑、接收距離。如表1所示，以二氯甲烷為有機溶劑，選用10萬相對分子質(zhì)量聚乳酸，濃度為30 g/L，24全因子試驗設計考察輸出電壓、推進速度、針頭內(nèi)徑、接收距離4個變量及其相互作用對微粒粒徑和粒徑分布的顯著性影響。在預實驗的基礎上設計了變量的高低水平，而4個中心點實驗的設計是為了評估過程的差異。采用MINITAB 15.0 版本，對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析。

表1 實驗因子和實驗水平

1.4 聚乳酸微球的形貌及粒徑表征

聚乳酸微球由掃描電鏡檢測形貌，將凍干的粉末樣品置于銅臺的導電膠上，噴金測試；根據(jù)掃描電鏡圖片，用軟件Adobe photoshop CS4分析微球的粒徑和粒徑分布。根據(jù)藥典規(guī)定，選擇500個微球，對其進行標記并測量其直徑。

1.5 制備前后聚乳酸的紅外光譜測定和 X射線粉末衍射分析

取等量的PLLA原材料和PLLA微球，以KBr壓片法制備樣品，在波數(shù)為4000～400 cm―1范圍內(nèi)經(jīng)傅里葉變換紅外光譜儀測試，記錄紅外光譜。

將PLLA原材料和PLLA微球分別均勻裝入石英樣品皿（約5 mm深）中，用特制的玻璃板將粉末整平、壓實，平放在樣品測試臺上測試。銅靶Kα1（λ=1.540598 ?）輻射；鎳（Ni）濾波片；NaI閃爍計數(shù)器；PSD位敏探測器；管電壓40 kV，管電流40 mA；連續(xù)掃描，掃描范圍5°～50°，掃描速度 Δ2θ=0.2°/s。

2 結(jié)果與討論

2.1 聚乳酸微球的粒徑和粒徑分布

表2為平均粒徑和粒徑分布的實驗結(jié)果，Span定義為(D90-D10)/D50，Span越小，粒徑分布越窄。

圖2(a)表示平均粒徑的主效應圖，圖 2(b)表示標準化效應的正態(tài)圖。從圖2 (a)中可看出，聚乳酸微球平均粒徑隨著溶液推進速度、針頭內(nèi)徑、接收距離的增大而增大，特別是推進速度的斜率比較大。而在測試范圍內(nèi)，聚乳酸微球平均粒徑隨著電壓增大而減小。Fukui等[12]報道海藻酸鈉/殼聚糖微膠囊的粒徑隨著推進速度、針頭內(nèi)徑、針尖與液面距離的增大而增大，隨電壓的增大而減小，與本工作的結(jié)果一致。圖2(b) 為標準化效應的正態(tài)圖，B點即溶液推進速度離斜線最遠，表明溶液推進速度是影響PLLA微球粒徑最顯著的影響因素，而D點、AD點也是較顯著的影響因素。AD為顯著性因素，說明A電壓和D接收距離有交互作用，電壓越高，接收距離越低，越有利于小粒徑微球的形成。這是因為在相同電壓下，接收距離越短，電場強度就越大，相當于提高電壓。Minitab全因子試驗結(jié)果表明溶液推進速度越小，接收距離越低，越有利于形成均一及小粒徑的微球。

表2 Minitab全因子試驗結(jié)果

圖2 Minitab分析

2.2 聚乳酸微球的表面形貌

2.2.1 推進速度對微球表面形貌的影響

圖3 不同推進速度下所制得的聚乳酸微球的掃描電鏡圖

圖4 最優(yōu)條件下制備的聚乳酸微球的表面形貌和粒徑分布

在其它條件不變的情況下，推進速度的變化導致相同時間內(nèi)擠出的聚合物溶液的量發(fā)生變化，推進速度越小，微球粒徑越小。圖3是在固定電壓為9 kV，聚乳酸相對分子質(zhì)量為10萬，濃度為30 g/L，針頭內(nèi)徑為0.26 mm，接收距離為40 mm等條件下，分別在10 mm/h和50 mm/h的推進速度下制得的聚乳酸微球。從 SEM 圖可知，微球的球形度良好，表面光滑；隨著推進速度的增大，粒徑分布變寬，同時較大粒徑微球的數(shù)量增多，這很可能是靜電噴射過程中隨著推進速度的不斷增大，造成液滴流容易產(chǎn)生橫向或扭曲不穩(wěn)定性[13-14]。靜電噴射制備微球的文獻報道中，在影響微球粒徑的所有參數(shù)中，控制粒徑大小最理想、最方便調(diào)節(jié)的參數(shù)就是推進速度。

2.2.2 最優(yōu)參數(shù)下聚乳酸微球的形貌和粒徑

根據(jù) Minitab軟件分析全因子試驗結(jié)果可知，在電壓為9 kV，聚乳酸相對分子質(zhì)量為10萬，濃度為30 g/L，推進速度為10 mm/h，針頭內(nèi)徑為0.20 mm及接收距離為20 mm等條件下，能得到表面光滑、球形度好、粒徑分布窄的單分散聚乳酸微球，平均粒徑為9.27 μm，span為0.80，見圖4。

2.3 聚乳酸分子量/濃度對微球形貌、粒徑的影響

在電壓為9 kV，推進速度為50 mm/h，聚乳酸濃度為30 g/L，針頭內(nèi)徑為0.26 mm，針尖與液面距離為20 mm的操作條件下，分別選取相對分子質(zhì)量為1.1萬、3萬、5萬、7.6萬和10萬的聚乳酸，制備得不同分子量的聚乳酸微球。結(jié)果表明1.1萬和3萬相對分子質(zhì)量的聚乳酸形成顆粒形狀較不規(guī)則，較多碎片顆粒形成，表面不光滑，粒徑分布不均勻。7.6萬相對分子質(zhì)量聚乳酸形成的微球粒徑較5萬、10萬相對分子質(zhì)量小，且球形度較好。總體來說，相對分子質(zhì)量為5萬～10萬的聚乳酸能夠形成球形度較好、粒度較均勻的微球（圖 5）。

圖5 不同相對分子質(zhì)量所制得的聚乳酸微球的掃描電鏡圖

圖6 不同濃度下所制得的聚乳酸微球的掃描電鏡圖

聚乳酸濃度高，含量高，黏度大，在相同電壓下，液體形成的霧滴較大，使得聚乳酸更不易在有機溶液中移動，傳質(zhì)效果減弱，液滴達到過飽和態(tài)的時間加長，所以形成的顆粒粒徑較大；并且高濃度的聚乳酸可能會降低電場強度，以致液滴無法被打碎形成更小的液滴，聚合物以纖維形式沉積出來的速率較顆粒形成速率快[15]，最終導致無法獲得顆粒。所以，高濃度不予考慮。如圖6所示，實驗結(jié)果表明，10 g/L和20 g/L濃度的聚乳酸難于形成球形的微粒。25 g/L、30 g/L和35 g/L的聚乳酸雖然能形成球形的微粒，但是結(jié)果表明30 g/L濃度時效果最佳。Taki等[16]已提出聚乳酸溶液，濃度不宜過大，Xie等[17]的研究結(jié)論也表明，濃度高的溶液所得顆粒易出現(xiàn)團聚現(xiàn)象，Berkland等[18]則發(fā)現(xiàn)，溶液濃度低有助于減小微球粒徑，縮小粒徑分布。

2.4 FTIR和XRPD分析

PLLA在1759 cm-1處有個特征吸收峰，意味著羰基的振動伸縮，范圍在1700～1900 cm-1間，經(jīng)高壓靜電抗溶劑法處理后，微球的特征吸收峰未轉(zhuǎn)移，振動范圍沒變化，證明無明顯結(jié)構(gòu)攝動，見圖7。

從圖8可知，經(jīng)高壓靜電處理后的PLLA微球與原料PLLA相比，晶體結(jié)構(gòu)方面未發(fā)生明顯變化。Koushik等[19]和Kang等[20]亦有類似的結(jié)果報道。

3 結(jié) 論

采用高壓靜電抗溶劑法成功制備出表面光滑、球形度好、粒徑均一的聚乳酸微球。

圖7 原料PLLA和PLLA微球的紅外光譜圖

圖8 原料PLLA和PLLA微球的XRD圖譜

通過MINITAB軟件設計全因子試驗對影響聚乳酸微球粒徑的制備工藝參數(shù)進行了顯著性分析。顯著影響微球粒徑的3個因素是：推進速度、接收距離、電壓和接收距離的交互作用。濃度為30 g/L，相對分子質(zhì)量為5萬～10萬的聚乳酸條件下制備的微球，球形度優(yōu)良。

經(jīng)過高壓靜電處理后，傅里葉紅外光譜測定表明，聚乳酸無明顯結(jié)構(gòu)攝動；X射線粉末衍射分析表明，聚乳酸晶體結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯變化。

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Development of poly (L-lactide) microspheres in high-voltage electrostatic antisolvent process

CHEN Aizheng1，2，YANG Yuemei1，WANG Shibin1，2，SUN Qingqing1，LIU Yuangang1，2，DANG Tingting1
(1School of Chemical Engineering，Huaqiao University，Xiamen 361021，F(xiàn)ujian，China;2Institute of Biomaterials and Tissue Engineering，Huaqiao University，Xiamen 361021，F(xiàn)ujian，China）

An antisolvent，absolute ethyl alcohol was used in the high-voltage electrostatic antisolvent process to prepare poly (L-lactide) microspheres. A 24factorial experiment was designed to investigate and identify the relative significance of the processing parameters on particle size and particle size distribution of the products. The results indicated that the effect of push speed was dominant in the results regarding particle size. After optimization，the resulting poly (L-lactide) microspheres exhibited good spherical shape，smooth surface and narrow particle size distribution. When the concentration and molecular weight of poly (L-lactide) were 3% (w/v) and 50～100 kDa respectively，the resulting microspheres showed good spherical shape. Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy measurement found no significant structural perturbation. X-ray powder diffraction (XRPD) analysis revealed no significant crystal structural changes.

high-voltage eletrostatic system；anti-solvent；poly (L-Lactide)；factorial experiment

R 318

：A

：1000-6613（2012）09-2024-07

2012-04-16；修改稿日期：2012-06-08。

國家自然科學基金（51103049，81171471，31170939）及福建省自然科學基金（2010J05027，2011J01223）項目。

陳愛政，博士，副教授，主要從事藥物緩控釋體系與組織工程方面的研究。聯(lián)系人：王士斌，教授，博士生導師，主要從事生物材料與組織工程方面的研究。E-mail sbwang@hqu.edu.cn。