PIK3CB、Akt及p-Akt在子宮內(nèi)膜癌中的表達及意義

張琛，楊清，王玉

（中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽 110004）

子宮內(nèi)膜癌作為發(fā)病率最高的女性盆腔生殖道惡性腫瘤之一，嚴重影響女性健康。許多信號轉(zhuǎn)導途徑與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展過程關系密切，其中磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）信號轉(zhuǎn)導途徑作為最主要的信號轉(zhuǎn)導途徑之一，在腫瘤細胞增殖、凋亡及侵襲中發(fā)揮著重要作用。本實驗采用免疫組化方法及Western blot檢測PIK3CB、Akt及p-Akt在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達情況，探討子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機制，為子宮內(nèi)膜癌的診治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

材料來源于中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院2005年1月至2007年12月婦科手術治療的患者。免疫組化實驗采用蠟塊標本58例，其中增殖期子宮內(nèi)膜6例，子宮內(nèi)膜非典型增生7例，子宮內(nèi)膜樣腺癌45例；病理分期：Ⅰ期21例，Ⅱ期14例，Ⅲ期10例；組織學分級：高分化（G1）15 例，中分化（G2）20 例，低分化（G3）10例。Western blot采用新鮮標本 30例，均為手術時取材，取材后立即送-70℃冰箱保存，其中增殖期子宮內(nèi)膜6例，子宮內(nèi)膜非典型增生6例，子宮內(nèi)膜樣腺癌18例。增殖期子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜非典型增生及子宮內(nèi)膜樣腺癌均經(jīng)病理學診斷證實，其中子宮內(nèi)膜樣腺癌根據(jù)世界衛(wèi)生組織/國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟手術病理分期標準進行分期，患者術前均未接受過放療、化療或激素治療。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學檢測：PIK3CB抗體購于美國Abcam公司，Akt、p-Akt抗體及SP試劑盒購于北京中杉金橋生物技術有限公司，SP免疫組化染色按試劑盒說明操作。免疫組化結(jié)果判定：PIK3CB、Akt及p-Akt陽性細胞染色均為棕黃色顆粒，定位于細胞質(zhì)。采用MetaMorph/DP10/BX41顯微圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。以積分光密度（integral optical density，IOD）代表蛋白顆粒密度。

1.2.2 Western blot檢測：取40 μg總蛋白上樣進行10%不連續(xù)SDS-PAGE電泳，通過電轉(zhuǎn)移法將蛋白從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素濾膜上，10%脫脂奶粉于室溫封閉濾膜過夜，常規(guī)將轉(zhuǎn)印后的膜依次與一抗和二抗孵育，最后以堿性磷酸酶法顯色目的條帶。Western blot結(jié)果判定：應用自動電泳凝膠成像分析儀（Alpha Innotech Corporation 5500型，美國Alpha Innotech公司）分析蛋白條帶的強弱（以IOD表示）。

1.3統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學檢測結(jié)果

免疫組化結(jié)果顯示PIK3CB、Akt及p-Akt均主要在胞質(zhì)內(nèi)表達，顯微鏡下表達陽性細胞可見胞質(zhì)呈棕黃色（圖1）。在增殖期子宮內(nèi)膜組織中，PIK3CB、Akt及p-Akt呈弱陽性表達或陰性表達，在子宮內(nèi)膜非典型增生組織及子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中的表達明顯增高（P<0.05），見表1。值得注意是，在不同臨床病理分期和不同組織類型病理分級的子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中PIK3CB表達量的差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；在不同組織類型病理學分級的子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中，Akt及p-Akt的表達量差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），但與臨床病理分期無關（P>0.05），見表 2。

表1 PI K3C B、Akt及p-Akt在不同子宮內(nèi)膜組織中表達的I O D值Tab.1 I nt egralopt i caldensi t y val ues ofPI K3C B，Aktand p-Akti n di f f erentendom et ri alt i ssues Group n PIK3CB Akt p-Akt Normal proliferative-phase endometrium 6 1.51±0.84 10.57±2.45 15.60±1.65 Atypical endometrial hyperplasia 7 9.96±13.151） 15.06±3.151） 32.89±5.401）Endometrial carcinoma 45 27.81±15.421），2） 38.59±2.871），2） 66.51±6.981），2）1）P<0.05 vs normal proliferative-phase endometrium；2）P<0.05 vs atypical endometrial hyperplasia.

2.2 Western blot檢測結(jié)果

Western blot定量分析 PIK3CB、Akt及 p-Akt的表達量，結(jié)果與免疫組化實驗的結(jié)果一致，在不同類型的子宮內(nèi)膜組織中PIK3CB、Akt及p-Akt蛋白的表達量差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），由增殖期子宮內(nèi)膜到子宮內(nèi)膜非典型增生到子宮內(nèi)膜樣腺癌呈增強趨勢。

表2 PI K3C B、Akt及p-Akt在不同組織學分級和病理分期子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中表達的I O D值Tab.2 I nt egralopt i caldensi t y val ues ofPI K3C B，Aktand p-Akti n di f f erentt ypes ofendom et ri aladenocarci nom a t i ssues by hi st ol ogi calgrade and pat hol ogi calst age Item n PIK3CB Akt p-Akt Histological grade G1 15 25.28±4.98 29.52±4.25 7.33±2.37 G2 20 28.44±3.40 38.84±3.02 12.18±1.43 G3 10 30.36±2.78 51.70±8.22 25.67±2.80 Pathological stageⅠ21 25.63±2.36 34.90±2.88 9.28±2.86Ⅱ14 25.01±1.50 48.90±2.26 12.05±3.07Ⅲ10 36.44±2.30 50.27±8.40 17.48±1.95

3 討論

PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展密切相關，催化亞基PIK3CB作為Ⅰ型PI3K的重要組成部分，在腫瘤的形成和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用：（1）抑制細胞凋亡，促進細胞增殖［1，2］。（2）介導細胞周期進展、促進細胞增殖：PIK3CB可以通過對周期素依賴性激酶的調(diào)節(jié)作用，促進細胞周期的運行。Cyclin E是屬于G期細胞周期的正調(diào)節(jié)因子，PIK3CB的下調(diào)可以導致Cyclin E顯著下降，從而影響細胞周期的進展［3］。（3）PIK3CB可以誘導致癌性轉(zhuǎn)化：多項研究表明，PIK3CB的高表達有潛在的誘導致癌性轉(zhuǎn)化作用［4，5］。這可能是因為PIK3CB過表達導致的PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導途徑的過度激活，促進腫瘤細胞的增殖。此外，PIK3CB不僅通過抑制細胞凋亡、促進細胞增殖而與腫瘤發(fā)生有關，還可影響腫瘤細胞的遷移、侵襲而促進腫瘤進展［6］。本研究發(fā)現(xiàn)，PIK3CB主要在細胞胞質(zhì)表達，在子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中的表達量明顯高于增殖期子宮內(nèi)膜組織和子宮內(nèi)膜非典型增生組織（P<0.05），Western blot結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致。由此可見，PIK3CB可能通過抑制子宮內(nèi)膜細胞正常凋亡而在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。Wee等［5］通過對前列腺癌PC3細胞系、人惡性膠質(zhì)瘤U87MG細胞系的研究表明，抑制PIK3CB的表達可以有效的下調(diào)p-Akt的表達，抑制PC3細胞及U87MG細胞的增殖，并促進其細胞凋亡，降低了腫瘤細胞的惡性生物學行為，在抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。在針對乳腺管癌［7，8］的研究中亦表明，敲除PIK3CB基因能有效地抑制了乳腺管癌細胞的增殖，促進其凋亡。進一步說明針對PIK3CB的干預治療有可能成為抑制腫瘤增殖和存活的一個新的治療方法，亦有可能成為子宮內(nèi)膜癌治療的一個新靶點。

Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，可抑制腫瘤細胞的凋亡，促進腫瘤細胞增殖：（1）Akt的活化可受大量細胞因子、生長因子的觸發(fā)，從而保護細胞免受凋亡。（2）過表達顯性失活突變Akt基因可促進凋亡，而過表達組成性激活突變Akt基因可抑制凋亡。Akt參與了多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，在乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌及胃癌中都檢測出了Akt的過表達［9］。有研究顯示Akt在胃癌組織中呈高表達，提示Akt蛋白的高表達可能促進胃癌細胞的增殖，抑制其凋亡。我們發(fā)現(xiàn)Akt在子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中亦呈高表達，表達量明顯高于增殖期子宮內(nèi)膜組織和子宮內(nèi)膜非典型增生組織（P<0.05），提示Akt的過表達可能促使子宮內(nèi)膜細胞逃避凋亡、異常增殖并促進子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生和發(fā)展。

p-Akt作為Akt的活化形式，在抑制腫瘤細胞凋亡、促進腫瘤細胞增殖和血管生成等方面發(fā)揮著重要作用。大量研究表明，在許多惡性腫瘤中p-Akt呈持續(xù)高度活化，而且p-Akt的異常表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及對放化療產(chǎn)生的耐受密切相關［10］。通過我們的研究證實p-Akt在子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中的表達明顯高于增殖期子宮內(nèi)膜及子宮內(nèi)膜非典型增生組織（P<0.05），表明Akt的磷酸化激活可能是促進子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、抑制其凋亡的重要原因。Aleskandarany等［11］對大宗病例的檢測結(jié)果顯示，76%的早期乳腺浸潤性導管癌中p-Akt呈高表達。同樣，對結(jié)直腸癌的研究提示p-Akt的表達與結(jié)直腸癌的TNM分期相關，推測p-Akt很可能在結(jié)直腸癌的生長和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，其高表達促進淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生。在本研究中還發(fā)現(xiàn)PIK3CB、Akt及p-Akt在子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中的表達量均明顯高于增殖期子宮內(nèi)膜組織及子宮內(nèi)膜非典型增生組織（P<0.05），由此推測在子宮內(nèi)膜癌中，PIK3CB的過表達能夠上調(diào)Akt及p-Akt的表達，促進子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖，抑制其凋亡，但三者之間的關系具體如何，還需進一步的研究證明。

綜上所述，深入研究PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，不僅有利于闡明子宮內(nèi)膜癌惡性增殖和存活的分子機制以及加深對PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路的了解，還能為臨床預測子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、基因治療和預后判斷提供新的有效靶點。

［1］An HJ，Cho NH，Yang HS，et al.Targeted RNA interference of phosphatidylinositol 3-kinase p110-β induces apoptosis and proliferation arrest in endometrial carcinomar cells［J］.J Pathol，2007，212（2）：161-169.

［2］Jia S，Zhang S，Liu P，et al.Essential roles of PI（3）K-p110β in cell growth，metabolism and tumorigenesis［J］.Nature，2008，454（7205）：776-779.

［3］CiraoloE，IezziM，MaroneR，etal.Phosphoinositide3-kinase p110beta activity：key role in metabolism and mammary gland cancer but not development［J］.Sci Signal，2008，1（36）：ra3.

［4］Ono A，Ishizuka T，Matsuzaki S，et al.PI3K-p110beta positively regulateslipopolysaccharide-induced IL-12 production in human macrophages and dendritic cells and JNK1 play a novel role［J］.J Immunol，2009，182（9）：5225-5231.

［5］Wee S，Wiederschain D，Maira SM，et al.PTEN-deficient cancers depend on PIK3CB ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105（35）：13057-13062.

［6］楊清，張淑蘭，王玉.子宮內(nèi)膜癌組織中p-PKB及僅含BH3域蛋白的表達及其相關性［J］.中國腫瘤臨床，2006，33（16）：912-915.

［7］Hashem A，Dbouk，Jonathan M.A beta version of life：p110β takes center stage［J］.Oncotarget，2010，1（8）：729-733.

［8］Dou Z，Pan JA，Lin RZ，et al.The beta identity of class I Ptdlns3K a positive role of p110β in autophagy revealed［J］.Autophagy，2011，7（2）：246-247.

［9］黃憲章，趙學芹，李曼，等.Akt shRNA載體的構建及其對結(jié)腸癌細胞株Lovo Akt基因表達的抑制作用［J］.南方醫(yī)科大學學報，2011，31（11）：1914-1917.

［10］周云英，劉華，郭銳翰，等.缺氧影響PTEN磷酸化和核定位［J］.首都醫(yī)科大學學報，2011，32（2）：244-248.

［11］Aleskandarany MA，Rakha EA，Ahmed MA，et al.Clinicopathologic and molecular significance of phoshpho-Akt expression in early invasive breast cance［J］.Breast Cancer Res Treat，2010，127（2）：407-416.