LC－MS法測定苦參總堿片中3種生物堿的含量

朱燕萍 王 軍 陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科 （咸陽 712083）

苦參中含有多種有效成分，苦參總堿為其主要藥效成份，具有抗心律失常、抗病毒、抗腫瘤、升白細胞的功效。能改善心肌細胞的離子轉(zhuǎn)運，降低心肌應(yīng)激性，使心率變慢，傳導(dǎo)延長，心肌興奮性降低，與目前臨床廣泛應(yīng)用的抗心律失常藥相比，具有高效，無毒、副作用少的特點［1］?？鄥⒖倝A片收載于黑龍江省藥品標(biāo)準(zhǔn)及衛(wèi)生部中藥成方制劑標(biāo)準(zhǔn)，用苦參總堿浸膏經(jīng)加工制成的中藥片劑，用于各種原因引起的心律失常，對室性早搏療效尤為顯著。我們建立了LC－MS法，檢測該制劑主要成分苦參堿、氧化苦參堿和槐果堿的含量，為其藥品標(biāo)準(zhǔn)修訂提供參考。

1 儀器與試藥 美國Agilent公司1100HPLC／MSD高效液相色譜／質(zhì)譜聯(lián)用儀。含在線脫氣機、雙高壓梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、電噴霧離子源、四極質(zhì)譜檢測器、Agilent化學(xué)工作站。氧化苦參堿、苦參堿和槐果堿（供含量測定用，由中國藥品生物制品檢定所提供）；苦參總堿片（由黑龍江龍桂制藥有限公司提供）。甲醇：色譜純，Merck公司；乙酸銨：分析純，南京化學(xué)試劑廠；氯仿：分析純，南京化學(xué)試劑廠；試驗用水均為Milli－Q超純水機制備。

2 方法與條件 2.1 色譜條件 色譜柱：VPODS柱，150mm×2.1mm（ID），5μm（島津）。柱溫：25℃。流動相：0.01mol·L－1乙酸銨水溶液：甲醇＝12：88；流速：0.2mL·min－1。電噴霧離子源參數(shù)：噴霧電壓為4000V；干燥氣為氮氣，流速10L·min－1；噴霧壓力40psi；溫度350℃；裂解器電壓：120V。離子化方式：電噴霧離子化，正離子方式；選擇離子檢測（SIM）：槐果堿 m／z 247.1，苦參堿 m／z 249.2，氧化苦參堿m／z 264.9。

2.2 供試品溶液的制備［2］取苦參總堿片10片（每片100mg），除去包衣后，精密稱定、研細，精密稱取適量，約相當(dāng)于苦參總堿100mg，置具塞錐形瓶中，加濃氨試液0.5mL，精密加入三氯甲烷100mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率33kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用三氯甲烷補足減失的重量，搖勻濾過。濾液通過中性氧化鋁柱（100～200目，8 g，內(nèi)徑1cm），用三氯甲烷洗脫2次，每次100mL，收集洗脫液，回收溶劑至干，殘渣加甲醇適量使溶解，并轉(zhuǎn)移至100mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0·45μm）濾過，精密量取濾液5mL，置50mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，做為供試品溶液。

2.3 對照品溶液的制備 分別精密稱取苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿對照品各5mg，分置25mL量瓶中，分別加甲醇適量，振搖使溶解，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，做為對照品儲備液備用，精密量取儲備液各2.5mL，置25mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品工作液。

2.4 線性關(guān)系的試驗 精密吸取不同量的氧化苦參堿、苦參堿、槐果堿對照品工作液適量，分別配成苦參堿濃度為100，200，1000，2000，8000，16000ng·mL－1；氧化苦參堿濃度為 200，400，2000，4000，20000，60000ng·mL－1；槐果堿濃度為50，100，200，500，2000，8000ng·mL－1，各進樣10μL，記錄峰面積，以對照品溶液濃度（C）與其相應(yīng)峰面積（Y），求回歸方程；結(jié)果表明苦參堿在（100－16000）ng·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程：Y＝84215C＋1E＋07，r＝0.9999；氧化苦參堿在（200－60000）ng·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程：Y＝26542C＋1E＋07，r＝0.9998；槐果堿在（50－8000）ng·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程：Y＝100892C＋3E＋06，r＝0.9997。

2.5 精密度考察 取同一份對照品溶液，進樣量10μL，重復(fù)進樣5次，測定峰面積，結(jié)果表明苦參堿RSD為0.97%，氧化苦參堿RSD為0.56%，槐果堿RSD為0.89%，說明本法精密度良好。

2.6 重復(fù)性考察 取同一批供試品，按供試品溶液制備方法制備5份供試液，測定苦參堿、氧化苦參堿和槐果堿含量。結(jié)果苦參堿RSD為1.02%，氧化苦參堿RSD為0.95%，槐果堿RSD為1.12%，說明本法具有良好重復(fù)性。

2.7 回收率試驗 采用加樣回收法，取已知含量的苦參總堿片，分別加入苦參堿，氧化苦參堿，槐果堿對照品，按上述色譜條件測定，并計算平均回收率。平均回收率分別為：99.2%、98.6%和98.9%。

2.8 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別在0，2，4，6，8h測定苦參堿、氧化苦參堿和槐果堿的峰面積，結(jié)果苦參堿RSD為0.83%，氧化苦參堿RSD為0.75%，槐果堿RSD為0.91%，表明制備的供試液在8h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 供試品的測定 對照液和供試品溶液各10μL進樣，按上述色譜條件測定，采用峰面積外標(biāo)法計算含量。三批供試品（100mg）的測定結(jié)果如下：

表1 樣品測定

3 討 論 苦參總堿片中主含苦參生物堿類成份，氯仿加濃氨溶液提取法為傳統(tǒng)的提取方法，分離苦參中的生物堿類物質(zhì)，文獻報道的HPLC法大都采用氨基柱和硅膠正相柱［3，4］，其流動相系統(tǒng)復(fù)雜且重復(fù)性不佳，經(jīng)過反復(fù)試驗考察，最后確定采用的色譜柱為VP－ODS柱，2.1mm×150mm，5μm。流動相系統(tǒng)采用的是揮發(fā)性乙酸銨和甲醇系統(tǒng)，可用于HPLC／MS分析，上述色譜系統(tǒng)中，3種苦參生物堿色譜行為較佳，保留時間適中，在本實驗所采用的提取條件下能提取完全。

中藥及其復(fù)方制劑的化學(xué)成分復(fù)雜，以單一成分控制其質(zhì)量顯然有些不足和滯后，從單一成分指標(biāo)測定到多成分指標(biāo)的同時測定來分析中藥成分，是中藥質(zhì)量控制的變化趨勢。［5］。本試驗采用LC－MS法同時測定苦參總堿片中苦參堿、氧化苦參堿和槐果堿的含量，線性關(guān)系良好，重復(fù)性及回收率試驗均符合要求，該方法快速、靈敏、穩(wěn)定，適合作該制劑的含量測定方法。

［1］趙 敏，金玄俊，邢武軍.苦參總堿治療心律失常50例療效分析［J］.心血管康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，1999，8（3）：58－59.

［2］趙煥霞.苦參片中苦參堿和氧化苦參堿的含量測定［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2008，14（2）：13－14.

［3］金莉霞，崔燕巖，章觀德.苦參生物堿的高效液相色譜法測定［J］.藥學(xué)學(xué)報，1993，28（2）：136－139.

［4］崔建芳，章觀德，王幕鄒.苦參與苦豆子中生物堿的高效液相層析法與薄層光密度法測定［J］.藥學(xué)學(xué)報，1985，20（1）：59－66.

［5］曹伶俐.苦參及其制劑的質(zhì)量控制研究進展［J］.陜西中醫(yī)，2010，31（10）：1410－1411.