食物過敏原標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究進(jìn)展

周 煌，楊安樹，佟 平，袁角建，陳紅兵，高金燕

(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330047;2.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西南昌330047;3.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江西南昌330047)

隨著社會(huì)的發(fā)展、人們飲食習(xí)慣及食物構(gòu)成的改變，食物過敏已逐漸成為影響部分人群生活質(zhì)量和身體健康的一大隱患。食物過敏又稱食物不良反應(yīng)，是人體對(duì)某些食物產(chǎn)生的變態(tài)反應(yīng)［1］，可出現(xiàn)多種臨床病癥，嚴(yán)重的會(huì)引發(fā)過敏性休克甚至死亡。據(jù)相關(guān)的流行病學(xué)研究表明，食物過敏約影響5%的兒童及3%～4%的成年人的健康，且呈增長(zhǎng)趨勢(shì)［2］。另外，90%的過敏反應(yīng)由蛋、魚、貝類、奶、花生、大豆、堅(jiān)果和小麥等8類高致敏性食物引起［3］。因此，為了有效地預(yù)防和控制食物過敏給人類健康帶來的危害，食物過敏原的檢測(cè)、診斷以及治療已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。毫無疑問，這些研究工作對(duì)食物過敏原標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制提出了新要求［4］。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(Reference Material，“RM”)是指已確定其一種或幾種特性，用于校準(zhǔn)測(cè)量器具、評(píng)價(jià)測(cè)量方法或確定材料特性量值的物質(zhì)［5］。目前，依照各國(guó)際組織和國(guó)家實(shí)際分類的特點(diǎn)，可將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)歸納成三種主要的分類方法:按特性量值學(xué)科分類、按標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)應(yīng)用領(lǐng)域分類、按標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)物理形態(tài)分類。在我國(guó)，按標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的應(yīng)用領(lǐng)域?qū)⑵浞譃?3類，包括鋼鐵、有色金屬及金屬中氣體、建材、核材料、高分子材料、化工產(chǎn)品、地質(zhì)礦產(chǎn)、環(huán)境化學(xué)、臨床化學(xué)與藥品、食品、煤炭和石油、工程和物理［6］。其中，食品也是其中的一大類。

表1 CREATE項(xiàng)目候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)理化性質(zhì)分析的參數(shù)和所選擇的分析方法［22］Table 1 Parameters and selected analytical methods for the physico-chemical characterization of Candidate Reference Materials in the CREATE project［22］

1 食物過敏原標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是一種實(shí)物標(biāo)準(zhǔn)，其種類繁多、應(yīng)用廣泛，在制備過程中，應(yīng)當(dāng)選擇合適的程序、工藝以及防止污染［7］。根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)管理委員會(huì)規(guī)定，我國(guó)一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制的全過程包括候選物的選擇、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性的檢驗(yàn)、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性的檢驗(yàn)、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值、標(biāo)準(zhǔn)值的確定及總不確定度的估計(jì)、定值結(jié)果的表示和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的包裝與貯存，該技術(shù)規(guī)范適用于化學(xué)成分、物理化學(xué)特性及工程技術(shù)特性一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制(二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制可參照一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范執(zhí)行)［8］。然而，與此不同的是，食物過敏原能夠引發(fā)人體的過敏反應(yīng)，故在通過一定的實(shí)驗(yàn)方法得到高純度的致敏性蛋白后，在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備過程中，除理化性質(zhì)外，還應(yīng)增加對(duì)其免疫學(xué)性質(zhì)的測(cè)定。

1.1 食物中主要致敏性蛋白的分離純化

食物過敏原標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)按照是否含有基體，可分為含基體的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和不含基體的純標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。含有基體的分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，如RM 8415(全雞蛋粉);不含基體的純標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)如針對(duì)雞蛋中的某個(gè)過敏原蛋白，如溶菌酶。對(duì)于不含基體的純標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，蛋白的純化是前提和基礎(chǔ)。目前，常用的純化方法包括沉淀法、膜分離法、柱層析法和電泳法，而柱層析法包括親和層析、凝膠過濾層析、疏水相互作用層析、離子交換層析和高效液相色譜。此外，由于生物技術(shù)、轉(zhuǎn)基因和基因工程技術(shù)的發(fā)展，食物過敏原重組技術(shù)的研究和發(fā)展也越來越受到人們的關(guān)注。迄今為止，人們針對(duì)某些致敏性食物中的主要過敏原進(jìn)行了大量的分離純化研究，尤其是雞蛋、牛奶、花生這三類高致敏性食物。顯而易見，這些研究工作為食物中單一過敏原標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備奠定了基礎(chǔ)。

1.1.1 雞蛋中主要過敏原的分離純化 雞蛋中的主要過敏原包括卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵類粘蛋白、卵白蛋白和溶菌酶。其分離純化的主要研究包括佟平等［9］采用DEAE-sepharose Fast Flow陰離子層析法，得到的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白純度高達(dá)97%。Dattaa等［10］采用兩步膜超濾法，分離得到的卵白蛋白純度高達(dá)98.7%;Chiang等［11］采用兩步法，先將蛋清液經(jīng)膜超濾，再過親和色譜柱，分離得到溶菌酶，其純度為96%，總回收率為79%，活力為 70400;Vachier 等［12］用Q-sepharose FF強(qiáng)陽(yáng)離子柱，一步從蛋清中分離出了溶菌酶、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和卵白蛋白三種主要過敏原，其純度分別為99%、75%和98%。

1.1.2 牛乳中主要過敏原的分離純化 牛乳中的主要過敏原有α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和酪蛋白。對(duì)于牛乳中主要過敏原的分離純化，Konrad等［13］采用超濾膜分離的方法，獲得純度為95%的α-乳白蛋白。蔡小虎［14］則采用過兩次離子柱的方法，分離出了β-乳球蛋白，SDS-PAGE鑒定其純度高達(dá)99%，得率為 34.46%。此外，Schlatterer等［15］和 Goodall等［16］則先后對(duì)β-乳球蛋白進(jìn)行分離純化，其純度均可達(dá)到99%。另外，張艷等［17］對(duì) αs、β-酪蛋白進(jìn)行分離，得到的αs-酪蛋白與β-酪蛋白純度分別為83.33%、109.53%。

1.1.3 花生中主要過敏原的分離純化 Ara h 1～Ara h 11是花生中已確認(rèn)的11種引起過敏的蛋白。對(duì)于花生致敏性蛋白，近年來，研究人員除了研究其天然過敏原的純化方法外，還進(jìn)行了基因工程重組的研究。例如，吳序櫟等［18］通過硫酸銨沉淀和兩步凝膠層析，純化得到的花生過敏原Ara h 1，SDS-PAGE鑒定其純度大于90%。張英坤等［19］將花生經(jīng)脫脂、粗提和DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析分離后，得到Ara h 2的純度達(dá)90%，得率為21.9%。胡純秋等［20］通過重組，并采用 Glutathione Sepharose 4B親和層析柱進(jìn)一步純化融合的GST-Ara h 2花生蛋白后，SDS-PAGE顯示其純度約為90%。此外，羅春萍等［21］通過脫脂、浸提、DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析分離得到Ara h 6，純度大于95%，得率為22.5%。

1.2 過敏原蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)理化性質(zhì)的表征

食物中致敏性蛋白理化性質(zhì)的表征可參照歐盟CREATE項(xiàng)目中所采用的方法。在CREATE中，作為候選過敏原標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，在評(píng)價(jià)其是否可作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)前，應(yīng)對(duì)其物理化學(xué)性質(zhì)(見表1)和免疫學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析，其中，理化性質(zhì)包括鑒定、純度、均一性以及二級(jí)結(jié)構(gòu)。此外，其穩(wěn)定性的評(píng)定采用的是英國(guó)國(guó)家生物標(biāo)準(zhǔn)與控制研究所使用的方法，即:先分析冷凍干燥處理對(duì)過敏原活性產(chǎn)生的影響，然后將冷凍干燥處理后的致敏性蛋白進(jìn)行熱加速降解處理，以觀察其長(zhǎng)期的穩(wěn)定性［22］。

1.3 過敏性蛋白候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)免疫學(xué)性質(zhì)的表征

對(duì)引發(fā)食物過敏的過敏原，須檢測(cè)特異性IgE與過敏原的結(jié)合能力，其目的是為了得知過敏原的致敏性大小。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，CREATE項(xiàng)目分析過敏原的免疫學(xué)性質(zhì)主要使用特異性人血清IgE反應(yīng)。該方法可通過RAST或斑點(diǎn)印跡直接測(cè)定IgE的結(jié)合能力，也可以采用RAST抑制性實(shí)驗(yàn)測(cè)定IgE的結(jié)合能力，另外，還可通過嗜堿性粒細(xì)胞組胺釋放實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步進(jìn)行IgE結(jié)合能力的評(píng)估［22］。

2 食物過敏原標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究現(xiàn)狀

相對(duì)而言，國(guó)外開展食物過敏原標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究起步較早。早在20世紀(jì)70年代，世界衛(wèi)生組織和國(guó)際免疫學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)(WHO/IUIS)就認(rèn)識(shí)到過敏原產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化的重要性。1981年，該聯(lián)合會(huì)建立了一個(gè)由學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)和過敏原制造商資助的項(xiàng)目，旨在生產(chǎn)能夠獲得世界衛(wèi)組織所認(rèn)可的過敏原提取物，并以此作為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)(IS)［22］。近年來，在食物過敏原蛋白標(biāo)準(zhǔn)化方面，國(guó)內(nèi)外進(jìn)行了大量的研究，并組建了有關(guān)食物過敏的專門研究機(jī)構(gòu)，如美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院(National Institute of Standards and Technology，NIST)。此外，還啟動(dòng)了一些重大項(xiàng)目，如歐盟資助的EuroPrevallProject和CREATE Project。在我國(guó)，針對(duì)食物過敏及其標(biāo)準(zhǔn)化的研究，則主要集中在高校和科研機(jī)構(gòu)，且剛剛起步。

2.1 國(guó)外食物過敏原標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究的重要機(jī)構(gòu)和重大項(xiàng)目

2.1.1 美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院(NIST)NIST是美國(guó)商務(wù)部直屬的一個(gè)研究院，成立于1901年，其主要任務(wù)之一是提供標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)參考數(shù)據(jù)。迄今為止，NIST提供了1200多種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其中也包括致敏性食物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，包括RM 8415(全雞蛋粉)、RM 8435(全牛奶粉)、RM 8418(小麥蛋白粉)、RM 8436(硬質(zhì)小麥粉)、RM 8437(硬紅小麥粉)、RM 8438(軟小麥粉)和 RM 8414(牛肌肉粉)(http://www.nist.gov/index.html)。從用途來看，這些標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)都是用于評(píng)價(jià)分析方法和校準(zhǔn)分析儀器，且主要用于測(cè)定其中的主要、次要和微量元素成分，而并非用于校準(zhǔn)檢測(cè)食物過敏原的ELISA分析方法［23-24］。

到目前為止，RM 8445(全雞蛋粉)是制備出的唯一一個(gè)用于食物過敏原檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，它是由美國(guó)食品藥品管理局(FDA)、食品協(xié)會(huì)(FPA)、加拿大衛(wèi)生部、歐盟標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與測(cè)量研究所(IRMM)和美國(guó)內(nèi)布拉斯加大學(xué)食物過敏研究和資源項(xiàng)目共同生產(chǎn)的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)經(jīng)FDA包裝并由NIST發(fā)布。此外，NIST還希望通過這些組織的合作，研制出其它用于過敏原檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)［25-26］。RM 8445是一種經(jīng)噴霧干燥制成的含多種致敏性蛋白的全雞蛋粉，與雞蛋中的單個(gè)主要過敏原標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相比，RM 8445的優(yōu)點(diǎn)在于更符合食品工業(yè)加工中實(shí)際所用的原材料，更具實(shí)用性。

2.1.2 EuroPrevall Project EuroPrevall Project是一個(gè)歐盟資助的多學(xué)科綜合研究項(xiàng)目，始于2005年，該項(xiàng)目包括17個(gè)歐洲成員國(guó)、67個(gè)合作伙伴、15個(gè)臨床組織和6個(gè)小中小型企業(yè)(SMEs)以及在歐洲先進(jìn)的過敏研究機(jī)構(gòu)，致力于研究“歐洲食物過敏的基本原理和發(fā)病率”(http://www.europrevall.org/)。之后，新西蘭、澳大利亞、俄羅斯、印度和中國(guó)也參與了該項(xiàng)目［27］。此外，EuroPrevall還強(qiáng)調(diào)對(duì)整個(gè)歐洲的食物過敏原進(jìn)行有效的管理，并研究食物過敏的社會(huì)經(jīng)濟(jì)學(xué)影響［28］。該項(xiàng)目主要研究如何生產(chǎn)及測(cè)定高質(zhì)量的食物過敏原，其目的主要是將其用于診斷食物過敏。此外，該項(xiàng)目還研究不同的加工方法對(duì)食物致敏性的影響。

通過對(duì)大量食物過敏原信息的收集，EuroPrevall建立了一個(gè)食物過敏原數(shù)據(jù)庫(kù) http://www.europrevall.org/。迄今為止，自該項(xiàng)目實(shí)施后，已從植物或動(dòng)物性食物來源中純化出了46種食物過敏原，并全面表征了其結(jié)構(gòu)、免疫學(xué)性質(zhì)并評(píng)估了其致敏性，其中也包含雞蛋、牛奶和花生中的主要過敏原［29］。而在 EuroPrevall數(shù)據(jù)庫(kù)建立前，國(guó)際上還出現(xiàn)了一些其它過敏原數(shù)據(jù)，例如，過敏原在線(http://www.allergenonline.org/)和國(guó)際免疫學(xué)會(huì)聯(lián)盟(IUIS)過敏原數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.allergen.org/)。國(guó)際免疫學(xué)會(huì)聯(lián)盟數(shù)據(jù)庫(kù)為過敏原提供了系統(tǒng)命名法，并由過敏原命名小組委員會(huì)授予官方稱謂［30］。這些數(shù)據(jù)庫(kù)的建立為廣大食物過敏原及其相關(guān)研究的學(xué)者提供了有關(guān)食物過敏原的相關(guān)信息。毫無疑問，在食物過敏原標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究階段，這些數(shù)據(jù)庫(kù)所提供的信息將為食物過敏的診斷及食物過敏原的標(biāo)準(zhǔn)化提供有力的支持。

2.1.3 CREATE Project 歐盟資助研究過敏的另外一個(gè)重大項(xiàng)目CREATE，始于2001年。該項(xiàng)目成立的目標(biāo)有兩個(gè):a.生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化的天然和重組主要過敏原候選有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，并應(yīng)達(dá)到一定的標(biāo)準(zhǔn)，這些標(biāo)準(zhǔn)包括獲得國(guó)際相關(guān)組織的認(rèn)可、過敏原含量已知、具有較高的純度以及良好的理化和免疫學(xué)性質(zhì);b.確認(rèn)夾心ELISA為主要過敏原檢測(cè)的方法，并在此基礎(chǔ)上對(duì)主要過敏原的含量進(jìn)行量化［31］。

迄今為止，CREATE項(xiàng)目共研發(fā)了18種過敏原，包括8種天然過敏原和10種重組過敏原。rBet v 1、rPhl p 1、rPhl p 5a 和 rPhl p 5b、rOle e 1、rDer p 1、rDer p 2、rDer f 1和rDer f 2是其代表性的重組過敏原分子。研究表明，通過比較重組過敏原與其天然過敏原的理化和免疫學(xué)性質(zhì)，有3個(gè)重組過敏原與其對(duì)應(yīng)的天然過敏原有很大的相似性，分別是重組白樺樹花粉過敏原(rBet v 1)、重組梯牧草花粉過敏原(rPhl p 5a)和重組屋塵螨過敏原(rDer p 2)。隨后，歐洲藥品和醫(yī)療質(zhì)量局生物制品標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)劃BSP090，對(duì)GMP條件下生產(chǎn)的rBet v 1進(jìn)行了一系列理化和生物學(xué)性質(zhì)的表征，研究證實(shí)，重組過敏原rBet v 1與其對(duì)應(yīng)的天然過敏原具可比性，并進(jìn)一步證明了rBet v 1可作為Bet v 1的候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)［32］。

雖然，CREATE項(xiàng)目所研究的不是食物過敏原，而主要是花粉和屋塵螨等過敏原標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備，但同樣作為致敏性蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究，其制備方案可為未來天然和重組食物過敏原標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制提供參考。

2.2 國(guó)內(nèi)食物過敏原標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究現(xiàn)狀

我國(guó)尚無針對(duì)食物過敏原蛋白的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，但我國(guó)在蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制方面已積累一些經(jīng)驗(yàn)，為我國(guó)食物過敏原蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究提供了良好的技術(shù)支撐。例如，中國(guó)計(jì)量科學(xué)院研發(fā)了3個(gè)濃度水平的牛血清白蛋白溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和2個(gè)濃度水平的糖基化血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。另外，衛(wèi)生部北京醫(yī)院研制出了氰化高鐵血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)［33］，北京出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心研制出了金黃地鼠羊瘙癢病理性朊蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)［34］。此外，我國(guó)在食物過敏研究方面，已成立了一些科研團(tuán)隊(duì)，例如，本實(shí)驗(yàn)室在食物過敏方面進(jìn)行了大量的研究，尤其在雞蛋、牛奶和花生過敏原的分離純化方面取得了顯著的成果。

由此可見，國(guó)內(nèi)有關(guān)食物過敏的研究相對(duì)滯后。我國(guó)未來在食物過敏原標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究方面的發(fā)展，除應(yīng)提高自身的科研能力外，還應(yīng)加強(qiáng)與國(guó)際研究機(jī)構(gòu)的溝通與協(xié)作。

3 結(jié)語(yǔ)

食物過敏是世界性難題，為了防止消費(fèi)者誤食過敏性食物，美國(guó)、日本和歐盟都都頒布了食物標(biāo)簽法，要求對(duì)食品中的8大類食物過敏原進(jìn)行標(biāo)注［35-36］。這一目標(biāo)的實(shí)施需要對(duì)過敏原進(jìn)行檢測(cè)，而且依賴標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)準(zhǔn)確檢測(cè)過敏原的種類和含量。通過以上綜述，可以看出:a.考慮食物復(fù)雜基體的影響及食物中某一主要過敏原純化的研究成果，食物中單一過敏原的標(biāo)準(zhǔn)化比對(duì)某種致敏性食物的標(biāo)準(zhǔn)化更容易實(shí)現(xiàn)，尤其是雞蛋、牛奶和花生這三類致敏性食物;b.重組過敏原為食物過敏原標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備開辟了一條嶄新的途徑。

總之，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及人們探索的不斷深入，食物過敏原標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究將邁向一個(gè)新的臺(tái)階。

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