響應(yīng)面法優(yōu)化黑加侖花色苷脂質(zhì)體制備工藝的研究

趙圣書(shū)，王振宇

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040)

花色苷是一類花色素與糖以糖苷鍵結(jié)合而成的類黃酮化合物，具有C6-C3-C6骨架?；ㄉ站哂锌寡趸?、清除自由基，減少低密度脂蛋白(LDL)、抗突變、抗腫瘤、改善視力作用等功能［1-2］，可廣泛應(yīng)用在食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域?；ㄉ諏?duì)光，溫度等外界條件較敏感，穩(wěn)定性較差［3］，導(dǎo)致產(chǎn)品中花色苷含量降低，影響了產(chǎn)品的質(zhì)量和實(shí)際使用效果;花色苷是水溶性色素，在腸道中吸收性不強(qiáng)，因此花色苷的穩(wěn)定性與生物利用率成為在其實(shí)際利用中的問(wèn)題。目前已有研究將花色苷制備成花色苷微膠囊，或者對(duì)花色苷進(jìn)行改性及輔色研究，提高了花色苷的穩(wěn)定性。而如何在避免改變花色苷的結(jié)構(gòu)的情況下，提高花色苷的穩(wěn)定性及生物利用率是一個(gè)難題。研究發(fā)現(xiàn)，以脂質(zhì)體作為藥物的載體，可以解決以上問(wèn)題，利用脂質(zhì)體包埋藥物以減少藥物損失，提高藥物穩(wěn)定性，促進(jìn)人體吸收利用。脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)類似生物膜，具有兩性性質(zhì)［4］，脂質(zhì)體劑型具有穩(wěn)定性高、緩釋效果好、靶向性高、利于藥物吸收、降低藥物毒性和副作用的特點(diǎn)［5-7］。制備脂質(zhì)體的常用方法有薄膜法，乙醇注入法，凍融法，逆向蒸發(fā)法，高壓均質(zhì)法，復(fù)乳法等［7-12］。本文利用脂質(zhì)體將花色苷進(jìn)行包覆，擬通過(guò)薄膜法結(jié)合超聲法制備花色苷脂質(zhì)體，以解決薄膜法制備脂質(zhì)體粒徑大及超聲法制備包封率不高的問(wèn)題;以大豆卵磷脂和膽固醇為膜材，通過(guò)對(duì)磷脂與膽固醇的比、花色苷濃度、制備溫度及大豆卵磷脂的添加量與包封率關(guān)系的研究，結(jié)合響應(yīng)面方法進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)而探求花色苷脂質(zhì)體制備的最有配方，獲得穩(wěn)定性好，生物利用率高的脂質(zhì)體。為開(kāi)發(fā)花色苷新劑型，擴(kuò)大其在保健食品行業(yè)的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花色苷 從黑加侖中分離純化獲得，哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院生物分離工程實(shí)驗(yàn)室提供;黑加侖 產(chǎn)地大興安嶺，純度92.73%，分子構(gòu)成為:花青素-3-半乳糖甙，花青素-3-呋喃阿拉伯糖甙，芍藥素-3-呋喃阿拉伯糖甙;PBS緩沖溶液 上海銳聰科技，純度98%;氯仿、乙醇、正辛醇 分析純;大豆卵磷脂 Sigma公司，色譜純;膽固醇 北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司。

KQ3200型水浴型超聲儀 昆山市超聲儀器有限公司;UV-2450型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取0.5g花色苷，以60%乙醇溶解定容于50mL作為花色苷原液。取2mL原液以PBS緩沖溶液(pH7.4)定容至25mL作為樣液。取1mL樣液分別用PBS稀釋成不同濃度，在最大波長(zhǎng)531nm下測(cè)定吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中樣液的花色苷含量以pH示差法測(cè)定［13］?；ㄉ諠舛扰c吸光度的回歸方程為:y=47.045x-0.0184，相關(guān)系數(shù)R2=0.9949，表明花色苷濃度和吸光度在0.005～0.032mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖1 花色苷PBS溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of anthocyanin

1.2.2 花色苷含量測(cè)定 取花色苷脂質(zhì)體懸濁液，用PBS緩沖液稀釋三倍于5mL離心管中，14000r/min離心30min，取上清，相同條件下離心，再取上清離心，重復(fù)三次。以相同條件制備的空白脂質(zhì)體為空白對(duì)照品，測(cè)定上清液的吸光度，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到花色苷的濃度。

1.2.3 脂質(zhì)體制備工藝流程 取0.1g大豆卵磷脂，0.025g膽固醇溶于10mL氯仿中，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，使瓶壁上形成均勻的薄膜。在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下加入PBS緩沖液(pH7.4)5mL、花色苷樣液2mL、0.5g玻璃珠，水浴超聲使膜脫落后加入10mL PBS緩沖液，40℃減壓旋轉(zhuǎn)30min，放置2h使花色苷脂質(zhì)體充分水化，轉(zhuǎn)移定容至25mL，依次過(guò)0.45、0.22μm濾膜，即得花色苷脂質(zhì)體懸濁液。相同條件下以PBS緩沖液代替花色苷樣液2mL作為空白對(duì)照品。

1.2.4 響應(yīng)面法工藝參數(shù)優(yōu)化 對(duì)制備溫度、花色苷加入量、卵磷脂:膽固醇、卵磷脂加入量進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以總花色苷含量為指標(biāo)，卵磷脂:膽固醇、溫度、花色苷為自變量，設(shè)計(jì)三因素三水平17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，因素水平編碼見(jiàn)表1。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理及分析 利用Design Expert8.0軟件中的多元線性回歸分析程序，擬合二階多項(xiàng)式方程，對(duì)回歸方程的系數(shù)進(jìn)行顯著性比較(F檢驗(yàn))，研究選取因素對(duì)花色苷脂質(zhì)體制備的影響。再利用Design Expert8.0將獲得的二階多項(xiàng)式方程轉(zhuǎn)化為響應(yīng)曲面，進(jìn)一步分析實(shí)驗(yàn)因素及水平對(duì)響應(yīng)值的影響。

表1 中心復(fù)合旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表Table 1 Coded factors and levels of Box-Behnken experimental design

1.2.6 包封率的計(jì)算 包封率(%)=(1-Cf/Ct)×100，Cf為游離花色苷含量，Ct為總花色苷含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同因素對(duì)花色苷脂質(zhì)體包封率影響

2.1.1 大豆卵磷脂加入量對(duì)包封率的影響 固定卵磷脂∶膽固醇比例4∶1，花色苷量0.08mg，制備溫度40℃，考察卵磷脂添加量 5、10、15、20、30、40mg/mL對(duì)包封率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。磷脂分散在水中形成囊泡，每一層均為磷脂雙分子層，因此大豆卵磷脂的加入量關(guān)系到脂質(zhì)體的成膜。由圖2可以看出，卵磷脂的濃度為5～10mg/mL時(shí)，磷脂雙分子層內(nèi)水相包裹了花色苷，脂質(zhì)體包封率升高;當(dāng)達(dá)到10mg/mL時(shí)內(nèi)水相的容積達(dá)到飽和，此時(shí)包封率最大;隨后磷脂量增加，包封率下降;卵磷脂加入量到20mg/mL以后，包封率變化不明顯。由此看出，當(dāng)卵磷脂添加量為10mg/mL時(shí)包封率最高，為60.50%。

圖2 卵磷脂添加量對(duì)包封率的影響Fig.2 Effect of lecithin content on the entrapment efficiency

2.1.2 花色苷加入量對(duì)包封率的影響 固定卵磷脂∶膽固醇 4∶1，卵磷脂添加量固定 0.1g，制備溫度40℃，考察花色苷量 0.04、0.08、0.12、0.16、0.2、0.24mg對(duì)包封率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3?；ㄉ兆鳛橐环N水溶性藥物，其添加量對(duì)脂質(zhì)體包封率有影響。花色苷添加量為0.04～0.12mg時(shí)，花色苷被包封于內(nèi)核水相中，脂質(zhì)體的包封率提高;在花色苷加入量為0.12mg時(shí)包封率達(dá)到最大，脂質(zhì)體內(nèi)水相包裹能力達(dá)到飽和;隨后花色苷添加量在0.12～0.16mg時(shí)，脂質(zhì)體的包封率下降，0.16mg后包封率趨于平穩(wěn)，這可能是由于脂質(zhì)體水相及油相的重新分配，花色苷析出，導(dǎo)致了趨勢(shì)的下降。由此看出，當(dāng)花色苷添加量為0.12mg時(shí)包封率最高，為67.08%。

圖3 花色苷加入量對(duì)包封率的影響Fig.3 Effect of anthocyanin content on the entrapment efficiency

2.1.3 卵磷脂:膽固醇對(duì)包封率的影響 固定卵磷脂添加量0.1g，花色苷量0.12mg，制備溫度40℃，考察卵磷脂∶膽固醇 1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1 對(duì)包封率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。卵磷脂與膽固醇的比對(duì)脂質(zhì)體包封率有影響，是由于膽固醇帶羥基的極性頭部與卵磷脂親水的頭部和兩條平行的疏水尾部相互間隔定向排列，形成脂膜，膽固醇對(duì)脂膜有雙向調(diào)節(jié)作用。國(guó)內(nèi)外已有文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，卵磷脂∶膽固醇在1∶1～5∶1 時(shí)包封率較高。如圖，當(dāng)卵磷脂∶膽固醇從1∶1～2∶1 時(shí)，包封率上升，并且在 2∶1 時(shí)包封率達(dá)到最大;隨后卵磷脂:膽固醇繼續(xù)變大，包封率反而下降，并在5∶1時(shí)達(dá)到平衡。這種變化是由于膽固醇使膜微黏度提高，雙分子層更穩(wěn)定牢固，當(dāng)膽固醇所占比例過(guò)大時(shí)，破壞了規(guī)律的雙分子層，組成的磷脂質(zhì)過(guò)少，成膜困難，穩(wěn)定性差，使包埋藥物泄露，包封率下降，由此可以看出，當(dāng)卵磷脂:膽固醇為2∶1時(shí)包封率最高，為71.60%。

圖4 卵磷脂:膽固醇對(duì)包封率的影響Fig.4 Effect of phospholipids/cholesterol ratio on the entrapment efficiency

2.1.4 溫度對(duì)包封率的影響 固定卵磷脂∶膽固醇2∶1，卵磷脂添加量 0.1g，花色苷量 0.12mg，考察制備溫度30、40、50、60、70℃對(duì)包封率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。溫度對(duì)花色苷脂質(zhì)體的包封率有影響，這是由于脂質(zhì)體的物理性質(zhì)同介質(zhì)溫度有密切關(guān)系。升高溫度時(shí)，脂質(zhì)體雙分子層的疏水鏈從有序排列變?yōu)闊o(wú)序排列，因而引起了膜物理性質(zhì)的系列變化，即發(fā)生了相變，這時(shí)有液態(tài)、液晶態(tài)和晶態(tài)共存，而膜的通透性變大，被包裹的藥物滲漏。如圖，當(dāng)溫度從30～50℃增大時(shí)，包封率上升，并于50℃達(dá)到最大，超過(guò)這個(gè)溫度后包封率減小。除此之外，過(guò)高溫度會(huì)造成花色苷的降解，而過(guò)低溫度成膜時(shí)間長(zhǎng)且不均勻。由此看出，當(dāng)制備溫度為50℃時(shí)包封率最高為70.88%。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖5 溫度對(duì)包封率的影響Fig.5 Effect of preparation temperature on the entrapment efficiency

表2 中心復(fù)合旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and its results

2.2.1 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及數(shù)值分析 為了確定最佳制備條件，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行中心組合實(shí)驗(yàn)(Box-Behnken)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和結(jié)果見(jiàn)表2，17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)分為兩類:析因點(diǎn)，自變量取值在X1、X2、X3所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，共有12個(gè);零點(diǎn)，為區(qū)域中心點(diǎn)，零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，用來(lái)估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差。

以花色苷脂質(zhì)體包封率為響應(yīng)值，經(jīng)回歸擬合后，各實(shí)驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響可以用下列函數(shù)表示:

進(jìn)一步對(duì)回歸方程進(jìn)行分析，其系數(shù)顯著性結(jié)果見(jiàn)表3。

從表3可以看出，此模型p＜0.01，響應(yīng)面回歸模型達(dá)到極顯著水平。相關(guān)系數(shù)R2=0.925505，表明92%的數(shù)據(jù)可以用模型方程解釋。由表3可以看出，影響包封率的因素主次順序?yàn)閄2＞X1＞X3。模型中對(duì)包封率的影響極顯著(p＜0.01)，X1X2對(duì)包封率的影響顯著(p＜0.05)，失擬項(xiàng)不顯著(p＞0.05)，因此該二次方程中實(shí)際值與預(yù)測(cè)值吻合度較高。

從回歸方程中看出:卵磷脂:膽固醇、溫度與包封率呈負(fù)相關(guān);也就是說(shuō)卵磷脂用量相對(duì)膽固醇越少效果越好，膽固醇用量越大越好。通過(guò)對(duì)函數(shù)的分析可以看出，卵磷脂:膽固醇在1.5∶1～2.0∶1之間，包封率可以達(dá)到74%以上。當(dāng)制備溫度升高時(shí)，脂質(zhì)體雙分子層發(fā)生了相變，導(dǎo)致膜的通透性變大，被包裹的藥物滲漏。因此制備溫度在一定范圍內(nèi)越低越好。

2.2.2 顯著交互作用對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響 為進(jìn)一步考察3個(gè)因素兩兩之間的交互作用對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響，對(duì)其響應(yīng)面曲線以及等高線圖進(jìn)行分析，從圖中可以直觀看出優(yōu)化區(qū)域，并可以在優(yōu)化區(qū)域內(nèi)根據(jù)脂質(zhì)體制備過(guò)程中的實(shí)際需要調(diào)整各因素的數(shù)值大小，從而得到包封率較高的花色苷脂質(zhì)體。如圖6～圖8所示。

圖6 卵磷脂∶膽固醇和溫度的交互作用Fig.6 Interactions between phospholipids/cholesterol ratio and temperature

由圖6可知，響應(yīng)曲面的坡度較陡，表明響應(yīng)值對(duì)卵磷脂:膽固醇和溫度的改變較敏感;等高線比較密，說(shuō)明溫度的變化對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響比卵磷脂:膽固醇的變化對(duì)包封率的影響大。當(dāng)花色苷量為0.12mg/mL時(shí)，卵磷脂:膽固醇與溫度的交互作用不顯著。由曲面圖可知，在一定的溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，包封率增加;溫度超過(guò)一定范圍后，包封率下降，可能是溫度過(guò)高時(shí)，花色苷發(fā)生了降解，導(dǎo)致包封率的下降。當(dāng)卵磷脂:膽固醇在1.5∶1～2∶1之間，溫度在45～50℃時(shí)，對(duì)花色苷脂質(zhì)體制備最有利，預(yù)測(cè)包封率為74.53%。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance Analysis and parameter estimation of the quadratic response regression model

圖7 卵磷脂∶膽固醇和花色苷量的交互作用Fig.7 Interactions between phospholipids/cholesterol ratio and anthocyanin content

圖8 花色苷量和溫度的交互作用Fig.8 Interactions between anthocyanin content and temperature

由圖7可知，從等高線的疏密程度可以看出，花色苷量變化對(duì)包封率的影響比卵磷脂:膽固醇的變化影響大。在提取溫度為50℃時(shí)，兩者交互作用較顯著，因?yàn)榈雀呔€的形狀反映交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小，橢圓形表示兩個(gè)因素相互作用較顯著。這表明適當(dāng)增加花色苷量利于包封率的提高。當(dāng)卵磷脂:膽固醇在1.5∶1～2∶1，花色苷量在 0.12～0.14mg 時(shí)，對(duì)花色苷脂質(zhì)體制備最有利，預(yù)測(cè)包封率為74.47%。

由圖8可知，響應(yīng)曲面的坡度較陡，表明響應(yīng)值對(duì)溫度和花色苷量的變化較敏感。從等高線的疏密程度可以看出，溫度變化對(duì)包封率的影響比花色苷量的變化影響大。在卵磷脂:膽固醇為2∶1時(shí)，兩者交互作用較顯著。這表明，在本實(shí)驗(yàn)水平范圍內(nèi)，適當(dāng)增大花色苷加入量有利于包封率的提高。當(dāng)溫度在45～50℃之間，花色苷量在0.12～0.14mg時(shí)，對(duì)花色苷脂質(zhì)體制備最有利，預(yù)測(cè)包封率為74.48%。

2.4.3 優(yōu)化提取工藝參數(shù)的驗(yàn)證 為了進(jìn)一步確證計(jì)算機(jī)模擬得到最佳點(diǎn)的值，對(duì)所得的回歸方程取一階偏導(dǎo)等于零并整理得:X1=-0.21，X2=-0.12，X3=0.06，Y=74.5436%。對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)條件:卵磷脂:膽固醇 1.79∶1(mg/mg)、溫度 48.80℃、花色苷量0.12mg，包封率為74.54%。失擬為0.8279＞0.05，以所得最佳反應(yīng)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)得包封率為72.9%，與模擬計(jì)算機(jī)值基本接近，表明預(yù)測(cè)值和真實(shí)值之間有很好的擬合性，進(jìn)一步驗(yàn)證了模型的可靠性。

3 結(jié)論

大多數(shù)水溶性藥物脂質(zhì)體的包封率低，因此使其作為新興藥物載體而得以應(yīng)用的基本條件之一就是獲得包封率高且均勻穩(wěn)定的脂質(zhì)體。本研究采用薄膜-超聲法制備花色苷脂質(zhì)體，著重對(duì)制備工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)選，結(jié)合響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，確定最優(yōu)的制備工藝條件，花色苷脂質(zhì)體包封率可達(dá)74.54%。

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