葛根黃酮的殼聚糖顆粒的制備及其釋放性研究

陳周潭，吳 暉，賴富饒，李曉鳳

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510640)

葛根為豆科葛屬植物，主要含葛根素、大豆苷等異黃酮類成分?，F(xiàn)代藥理研究證明，葛根中所含的有效成分葛根總黃酮具有降低心肌耗氧量，改善微循環(huán)，顯著減少低氧性內(nèi)皮細胞凋亡等作用［1-4］。而對糖尿病小鼠的實驗中，發(fā)現(xiàn)葛根黃酮具有降低血糖，預防和輔助治療糖尿病的前景［5］。但葛根中的主要成分葛根素的水溶性差，口服后難以被吸收，絕對生物利用度很低，只有3.75%左右［6］。殼聚糖顆?？梢詫⒒钚晕镔|(zhì)包裹在其中，增強活性物質(zhì)穩(wěn)定性，并具有非常好的藥物傳遞作用。因為它們的顆粒直徑往往小于1000nm，能有效提高吸收率［7］。殼聚糖(chitosan)是由自然界廣泛存在的幾丁質(zhì)經(jīng)過脫乙酰作用得到的，化學名稱為聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖。磷酸三苯酯(TPP)是一種無毒性聚陰離子，可以通過靜電鏈接和殼聚糖交聯(lián)在一起，形成粒子交聯(lián)網(wǎng)絡，對葛根黃酮進行包裹，改善釋放性能同時增加藥物穩(wěn)定性以及便于入藥［8］。本實驗以包埋率為指標考察了葛根黃酮的殼聚糖顆粒制備條件，并對其性質(zhì)進行初步分析，同時對葛根黃酮顆粒的體外釋放進行了評價。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葛根黃酮提取液 實驗室自制黃酮，純度約75%;殼聚糖 脫乙酰度90%，國藥集團化學試劑有限公司;葛根素標準品、三聚磷酸鈉(TPP)純度90%，翔博生物;乙醇、乙酸、鹽酸 天津大茂化學試劑廠。

FA2204B電子天平 HANGPING;752s紫外可見分光光度計 Spectrumlab;磁力攪拌器HJ-6 予華儀器有限責任公司;恒溫振蕩器CHZ-82A 富華儀器有限公司;5804R臺式高速冷凍離心機Eppendon;FJ-200高速分散均質(zhì)儀 上海標本模型廠;X射線衍射儀 德國Bruker公司(D8 Advance);S-3700N掃描電子顯微鏡 日本日立公司;ALPHR1-2冷凍干燥機 德國Christ。

1.2 實驗方法

1.2.1 葛根黃酮含量的測定

1.2.1.1 以葛根素為標準物的標準曲線的繪制 準確稱取干燥恒重的葛根素標準品5mg于25mL容量瓶中，用95%乙醇定容，搖勻備用;取上述葛根素標樣溶液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.7、0.8、0.9、1.0mL 分別置于10mL容量瓶中，加乙醇補至1mL，再加去離子水定容，搖勻。取1.0mL乙醇，加水定容到10mL，作為空白對照，在250nm波長下測吸光度值，以測得的數(shù)據(jù)作圖，得到回歸方程:y=0.146x-0.0006，R2=0.9995。其中吸光度為橫坐標，葛根素濃度為縱坐標［9-10］。

1.2.1.2 葛根黃酮含量的測定 取1mL待測液置于10mL容量瓶中，用95%乙醇溶液補充至刻度。搖勻后取1mL于10mL容量瓶中，以去離子水補充至刻度，搖勻后，在250nm波長下測吸光度，然后由葛根素標準曲線計算出待測液中總黃酮的含量。

1.2.2 葛根黃酮殼聚糖顆粒的制備 殼聚糖溶液的制備，將 0.04、0.08、0.12、0.16、0.2g 的殼聚糖分別加入到20mL的1%(m/v)乙酸溶液中充分攪拌溶解。

TPP 溶液的制備，將0.04、0.08、0.12、0.16、0.2g 的TPP分別加入20mL的蒸餾水中充分攪拌溶解。

將1mL的6mg/mL的葛根黃酮提取液加入殼聚糖溶液內(nèi)，用高速均質(zhì)機8000r/min均質(zhì)10min。均質(zhì)后的混合溶液，立刻置于磁力攪拌器上持續(xù)攪拌，并用1mL注射器(直徑為0.5mm的0.5號針頭)逐滴緩慢加入TPP溶液，并繼續(xù)攪拌1h使其形成粒子交聯(lián)網(wǎng)絡充分包裹葛根黃酮。最后將溶液4000r/min，離心20min，取其沉淀物，用蒸餾水沖洗后冷凍干燥制成極細小顆粒［11-12］。

1.2.3 包埋率的測定 取上一步的離心上清液，經(jīng)0.2μm的微孔過濾膜過濾，用紫外線分光光度法測定其濃度。

式中:C為上清液葛根黃酮濃度，V為溶液總體積，M為原溶液的葛根黃酮總量。

1.2.4 葛根黃酮的殼聚糖顆粒的形態(tài)觀測 將冷凍干燥后的葛根黃酮顆粒用掃描電子顯微鏡掃描，放大1000倍和3000倍觀察并拍攝照片。

1.2.5 X-射線衍射分析 分別取適量的殼聚糖、TPP、葛根黃酮提取物、按實驗得出的最優(yōu)配方比例的三者物理混合物、葛根黃酮顆粒冷凍干燥粉末，五種樣品進行 X-射線衍射分析，掃描范圍為 5～80°［13］。

1.2.6 葛根黃酮的殼聚糖顆粒的體外釋放研究 將0.5g葛根黃酮的殼聚糖顆粒冷凍干燥粉末(約含3.8mg葛根黃酮)，置于250mL的錐形瓶中，加入100mL pH為1的鹽酸溶液。將錐形瓶置于37℃的恒溫水浴搖箱中以100r/min的頻率振蕩。分別在0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、6、7、8、10、12h 取 3mL 溶液，4000r/min離心5min后取上清液，經(jīng)0.2μm的微孔過濾膜過濾，用紫外線分光光度法測定其濃度，并計算出釋放量，制成釋放曲線［14］。

2 結(jié)果與討論

2.1 殼聚糖顆粒比例的確定

用不同比例的殼聚糖溶液和TPP溶液制作葛根黃酮的殼聚糖顆粒，包埋率的結(jié)果如表1所示。

表1 不同配料比的殼聚糖溶液和TPP溶液制作葛根黃酮的殼聚糖顆粒的包埋率(%)Table 1 The embedded rate of pueraria flavonoids particles by different chitosan and TPP(%)

殼聚糖和TPP的反應是由于殼聚糖上帶正電的氨基與TPP上帶負電的磷酸基的靜電相互作用，因此兩者的比例不同，包埋率也會大不相同。殼聚糖是主要包裹材料，而TPP主要起靜電連接作用，因此葛根黃酮的包埋率主要受到殼聚糖濃度的影響。由該表可以看出殼聚糖是主要影響因素，在同一濃度的殼聚糖條件下，TPP濃度在到達某一閾值后包埋率幾乎不再提高。這是由于溶液中離散的殼聚糖的靜電連接作用，大部分已經(jīng)連接在一起，TPP濃度的增加無法進一步提高殼聚糖之間的連接，因此包埋率也不再提高。而同一濃度的TPP條件下，隨著殼聚糖濃度的提高，葛根黃酮的包埋率先上升后下降。下降的原因可能是由于當溶液中的殼聚糖含量接近1%時，溶液的粘度過大而不易于攪拌和充分混合，導致包埋率的下降。

因此最后得出最佳的配料比是20mL的0.6%殼聚糖溶液、20mL的0.6%的TPP溶液、1mL的6mg/mL葛根黃酮提取液。

2.2 葛根黃酮的殼聚糖顆粒制備效果

將冷凍后干燥后的制備顆粒置于掃描電子顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖1～圖2所示。由此可知，葛根黃酮的殼聚糖顆粒大小均勻，粒徑在2～3μm之間。

由于實驗條件和便利性的限制，本實驗采用1mL注射器逐滴加入TPP溶液，并使用真空冷凍干燥對其干燥處理。推測如果使用微量進樣器緩慢滴加TPP溶液，并在殼聚糖充分包裹葛根黃酮后，使用噴霧干燥處理，可以得到更加細小的納米級顆粒。

2.3 X－射線衍射分析

對葛根黃酮提取物、殼聚糖、TPP、按制備配方比例的三者的混合物、葛根黃酮的殼聚糖顆粒冷凍干燥粉末進行X-射線衍射分析結(jié)果見圖3～圖7。葛根黃酮提取物、殼聚糖、TPP的物理混合物中，各種物質(zhì)的特征峰依舊存在，而在葛根黃酮的殼聚糖顆粒的冷凍干燥粉末譜線中，殼聚糖在21°的特征峰和TPP 在19°和 33°的特征峰都明顯減弱，其 22～32°的峰型和三者物理混合物的光譜也完全不同，總體上，前四種物質(zhì)的峰位和峰強都有不同程度的改變甚至消失。這說明葛根黃酮提取物的殼聚糖顆粒是完全不同于與三者物理混合物的新物象。

圖1 葛根黃酮的殼聚糖顆粒在電子顯微鏡下(×1000)Fig.1 SEM picture of pueraria flavonoids particles(×1000)

圖2 葛根黃酮的殼聚糖顆粒在電子顯微鏡下(×3000)Fig.2 SEM picture of pueraria flavonoids particles(×3000)

圖3 葛根黃酮提取物的X-射線衍射結(jié)果Fig.3 X-ray diffraction result of pueraria flavonoids extraction

圖4 TPP的X-射線衍射結(jié)果Fig.4 X-ray diffraction result of TPP

2.4 葛根黃酮的殼聚糖顆粒的體外釋放曲線

根據(jù)葛根黃酮的殼聚糖顆粒在pH為1的鹽酸溶液中的釋放結(jié)果，以時間(h)為橫坐標，釋放量為縱坐標制成釋放曲線，結(jié)果見圖8。由圖可知葛根黃酮在4h內(nèi)，釋放量達到約60%，8h達到了80%，12h釋放量更是達到了90%，葛根黃酮在整個釋放過程中緩慢釋放，釋放狀況良好?？梢妼⒏鸶S酮提取物包裹在殼聚糖形成的顆粒當中，可以有效提高葛根黃酮的吸收率和生物利用率。

圖5 殼聚糖的X-射線衍射結(jié)果Fig.5 X-ray diffraction result of chitosan

圖6 三者物理混合物的X-射線衍射結(jié)果Fig.6 X-ray diffraction result of the three physical mixture

圖8 葛根黃酮的殼聚糖顆粒在PBS緩沖溶液中的釋放曲線Fig.8 The release curve of pueraria flavonoids particles in PBS buffer solution

3 結(jié)論

利用三聚磷酸鈉(TPP)通過靜電鏈接和殼聚糖交聯(lián)在一起，形成粒子交聯(lián)網(wǎng)絡，對葛根黃酮進行包裹，制成葛根黃酮的殼聚糖顆粒。其最佳顆粒制備條件為6mg/mL的1mL葛根黃酮溶液，0.6%(m/v)的20mL殼聚糖溶液，0.6%(m/v)的20mL TPP溶液，包埋率達到了67.1%，在掃描電鏡下可觀察到葛根黃酮的殼聚糖顆粒的成形效果良好。

同時，對葛根黃酮的殼聚糖顆粒的體外釋放實驗表明，葛根黃酮的釋放緩慢且完全，在12h內(nèi)釋放量達到了90%?？梢娭瞥杉毿〉墓腆w顆粒后能有效提高葛根黃酮的生物利用率，在其醫(yī)療保健方面具有良好的應用前景。

本實驗采用0.5號針頭的1mL注射器逐滴加入TPP溶液，并使用真空冷凍干燥對其干燥處理，制備成的葛根黃酮的殼聚糖顆粒還不夠細小且粒徑不夠均勻。在后期實驗中，可以采用針頭孔徑更加細小的微量進樣器緩慢滴加TPP溶液至殼聚糖葛根黃酮混合液中，并使用噴霧干燥機干燥，以期得到細小至納米級的顆粒和更加均勻的形態(tài)，并提升包埋率和進一步提高葛根黃酮的生物利用率。

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