響應(yīng)面法優(yōu)化南極磷蝦殼中蝦青素提取條件的研究

張曉燕，劉 楠，朱蘭蘭，周德慶，*

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東青島266071;2.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003)

蝦青素(Astaxanthin)全稱 3，3＇-二羥基-4，4＇-二酮基-β，β＇-胡蘿卜素，屬于非維生素A源類胡蘿卜素，不溶于水，易溶于二氯甲烷、丙酮、氯仿等大多數(shù)有機(jī)溶劑［1］。蝦青素具有高效抗氧化［2-3］、抗癌變［4］、增強(qiáng)免疫［5-6］及著色等功能［7］，近年來受到食品、醫(yī)藥、化妝品、水產(chǎn)養(yǎng)殖等行業(yè)的關(guān)注［8］，人們對于生產(chǎn)天然蝦青素表現(xiàn)出極大的興趣。目前從甲殼類中提取天然蝦青素是生產(chǎn)的主要途徑之一。南極磷蝦在南極生態(tài)系統(tǒng)中起著至關(guān)重要的作用，是整個南大洋生態(tài)系統(tǒng)中能量和物質(zhì)流動的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［9］。南極磷蝦生物量巨大，約為 6.5～10 億 t［10］，最近幾年的年捕撈量為十幾萬噸［11］。南極磷蝦體內(nèi)蝦青素含量豐富，有研究表明其體內(nèi)高于95%的色素都以蝦青素的形式存在。近年來隨著市場對于天然蝦青素的需求越來越大，南極磷蝦作為一種重要的漁業(yè)資源，越來越受到人們的重視。本文研究南極磷蝦殼中蝦青素提取過程中各參數(shù)對其提取率的影響，采用響應(yīng)面法對提取條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)提取條件，為南極磷蝦的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南極磷蝦 由遼寧省大連海洋漁業(yè)集團(tuán)公司提供，冷凍方式運到實驗室并在-20℃冰柜中貯藏;蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%以上)購于Dr.Ehrenstorfer GmbH，德國;濃鹽酸、二氯甲烷等試劑 均為分析純。

BSA124S-CW電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;T6新銳-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;DHG-9023型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司;SHZ-82恒溫振蕩器 常州國華儀器有限公司;A-1000S型水流抽氣機(jī) 上海愛朗儀器有限公司;Milli-Q Advantage超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及樣品含量的測定

1.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用二氯甲烷溶劑為提取劑，稱取2.5mg蝦青素標(biāo)準(zhǔn)樣品，溶于二氯甲烷溶劑，配制成蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液，于400～700nm光波長范圍內(nèi)掃描最大吸收波長及吸光值。實驗結(jié)果表明蝦青素在二氯甲烷溶液中最大吸收波長為480nm，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程見式(1)。

式中:x-蝦青素濃度，μg/mL;y-溶液吸光值A(chǔ)。線性回歸相關(guān)系數(shù)顯著，表明蝦青素質(zhì)量濃度在0～6μg/mL范圍內(nèi)具有線性關(guān)系。

1.2.1.2 樣品含量的測定 按式(1)得出粗提液中蝦青素的濃度，從而得到蝦青素提取率。公式見式(2)

式中:x-蝦青素濃度，μg/mL;V-蝦青素粗提液體積，mL;N-稀釋的倍數(shù)，本實驗中為10;M-蝦殼濕重，g。

1.2.2 單因素實驗 參考相關(guān)的文獻(xiàn)資料［12-14］，以蝦青素提取率為指標(biāo)，進(jìn)行單因素實驗考察二氯甲烷料液比、提取時間、提取溫度和提取級數(shù)對蝦青素提取率的影響。實驗因素及其水平見表1。

表1 單因素實驗水平表Table 1 Factors and levels of single-factor experiment

1.2.3 響應(yīng)面實驗 在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用 Design Expert(Vision 7.1.6)軟件，按照 Box Benken設(shè)計原理，以蝦青素提取率作為響應(yīng)函數(shù)，選取適當(dāng)?shù)捻憫?yīng)面因素及其水平，通過響應(yīng)曲面分析回歸得出自變量與響應(yīng)函數(shù)之間的統(tǒng)計模型，確定蝦青素提取最佳工藝條件。實驗因素水平編碼如表2所示。

表2 因素水平表Table 2 Factors and levels of RSM

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 料液比對蝦青素提取率的影響 由圖1可得出，在本次實驗范圍內(nèi)，料液比為1∶5g/mL時，蝦青素的提取率達(dá)到最大值;整個曲線呈先上升后下降趨勢，可能是因為料液比低時，蝦殼與二氯甲烷接觸不充分，提取不完全導(dǎo)致提取量低;而料液比過高時，提取液的體積大導(dǎo)致蝦青素受光、熱的破壞變多，蝦青素分解或變性，提取量隨之降低。因此選取1∶4、1∶5、1∶6g/mL 作為料液比的響應(yīng)面水平。

圖1 不同提取料液比的效果比較Fig.1 Effect of ratio on astaxanthin extraction

2.1.2 提取時間對蝦青素提取率的影響 由圖2可得出，在本次實驗范圍內(nèi)，提取時間為7h時提取率最大;而超過7h，提取率反而略有下降。分析原因可能是由于蝦青素提取完全需要一段時間保證蝦殼與二氯甲烷溶劑充分接觸，提取時間短，接觸不充分使得提取率低;提取時間過長則引起蝦青素的分解或變性。因此選取6、7、8h作為提取時間的響應(yīng)面水平。

圖2 不同提取時間的效果比較Fig.2 Effect of time on astaxanthin extraction

2.1.3 提取溫度對蝦青素提取率的影響 由圖3可知，本次實驗范圍內(nèi)，30℃下蝦青素的提取率最大。低于30℃時，蝦青素與二氯甲烷反應(yīng)不充分，不能完全浸提;溫度提高，蝦青素本身的不穩(wěn)定性造成分解或者變性，導(dǎo)致提取率下降，因此選取20、30、40℃作為提取溫度的響應(yīng)面水平。

圖3 不同提取溫度的效果比較Fig.3 Effect of temperature on astaxanthin extraction

2.1.4 提取級數(shù)對蝦青素提取率的影響 按3次提取總量為100%計，由表3中每級提取率可以看出，二級提取后蝦青素已經(jīng)大部分被提取，三級提取率很小。從經(jīng)濟(jì)等各角度綜合考慮，最終確定最佳提取級數(shù)采用二級。

表3 不同提取級數(shù)的效果比較Table 3 Effect of times on astaxanthin extraction

2.2 響應(yīng)面模型擬合

當(dāng)多因素影響提取效果時，響應(yīng)面是一種有效的優(yōu)化方法［15］。蝦青素提取實驗結(jié)果見表4，利用Design Expert V7.1.6軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行分析。通過逐步回歸對實驗數(shù)據(jù)(表4)進(jìn)行回歸擬合，得到料液比、提取溫度、提取時間3個自變量的二次多項回歸方程:

Y=-2.169.3278+4346.40822A+38.16529B+365.34574C-26.34848AB-213.85606AC-0.496BC-4977.95833A2-0.47987B2-22.00975C2

表4 響應(yīng)面設(shè)計與實驗結(jié)果Table 4 Test design and results of RSM

進(jìn)一步對該回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表5。由表5可知，模型p＜0.01，表明模型極顯著，不同處理間的差異極顯著。失擬項反映實驗數(shù)據(jù)與模型不相符的情況，該模型的失擬項(p＞0.05)不顯著，說明模型選擇正確。模型的決定系數(shù)R2=0.9989，矯正決定系數(shù) Adj R2=0.9975，表明響應(yīng)值變化的99.75%能用該模型來解釋，故該模型擬合程度好，實驗誤差小，可有效分析和預(yù)測二氯甲烷溶劑提取蝦青素的效果。此外，從方差分析中還可以看出該實驗條件范圍下各參數(shù)對提取效果影響的大小順序:提取溫度＞提取時間＞料液比。

2.3 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對各實驗因素所構(gòu)成的三維空間的曲面圖，從響應(yīng)面分析圖上可以找出最佳參數(shù)以及各參數(shù)之間的相互作用，而等高線的形狀可以反映出各因素之間的交互作用的強(qiáng)弱趨勢［16］。根據(jù)回歸分析結(jié)果制作等高線及響應(yīng)曲面見圖4～圖6。通過等高線和響應(yīng)曲面圖確定各因素的最佳水平范圍以及各因素之間的交互作用強(qiáng)弱。

圖4顯示了料液比和提取溫度對蝦青素提取率的影響，從圖中可以看出當(dāng)提取溫度恒定時，蝦青素提取率隨著料液比的增大，呈先上升后緩慢下降的趨勢，這和單因素實驗結(jié)果是一致的。可見選擇適當(dāng)?shù)牧弦罕群吞崛囟?，既可以得到較高的蝦青素提取率同時可以達(dá)到環(huán)保經(jīng)濟(jì)的目的。由響應(yīng)面圖的形狀可以看出料液比和提取溫度兩者間的交互作用顯著。

表5 回歸模型系數(shù)方差分析Table 5 ANOVA for the regressioncoefficients of model

圖4 料液比和提取溫度對提取率的影響Fig.4 Interactive effects of ratio and temperature on astaxanthin extraction

圖5顯示了料液比和提取時間對蝦青素提取率的影響，從圖中可以看出提取時間對蝦青素提取率的影響顯著，當(dāng)提取時間超過7h后，蝦青素提取率隨著提取時間的延長而迅速下降，原因可能是蝦青素不穩(wěn)定性，在空氣中暴露的時間越長，分解或變性越嚴(yán)重，導(dǎo)致蝦青素提取量下降。由響應(yīng)面圖的形狀可以看出料液比和提取時間之間的交互作用較顯著。

圖5 料液比和提取時間對提取率的影響Fig.5 Interactive effects of ratio and time on astaxanthin extraction

圖6顯示了提取溫度和提取時間對蝦青素提取率的影響，從圖中可以看出當(dāng)提取時間一定時，蝦青素提取率隨著提取溫度的升高而迅速提高。因為蝦青素的不穩(wěn)定性，隨著溫度的提高，蝦青素分解或變性的可能性變大，因此提取溫度過高對蝦青素提取率的影響是負(fù)面的。由響應(yīng)面圖的形狀可以看出，提取溫度和提取時間兩者之間的交互作用顯著。

圖6 提取溫度和提取時間對提取率的影響Fig.6 Interactive effects of temperature and time on astaxanthin extraction

2.4 提取條件的優(yōu)化及驗證

對二次多項回歸模型進(jìn)行最優(yōu)求解，得出二氯甲烷溶劑提取蝦青素過程中提取料液比、提取溫度以及提取時間對于提取率的最優(yōu)值分別為1∶4.76g/mL、30.5℃、6.95h，蝦青素提取率理論最大值為131.591μg/g(濕重)。為實際操作方便，確定最優(yōu)條件是料液比為1∶5g/mL，提取溫度為30℃，提取時間為7h。為檢驗結(jié)果的可靠性，采用響應(yīng)面優(yōu)化的最佳條件進(jìn)行3次驗證實驗，實驗得出的131.56μg/g(濕重)，與理論值接近，說明模型能較好地預(yù)測蝦青素提取情況。

3 結(jié)論

本次實驗采用響應(yīng)面優(yōu)化實驗，對南極磷蝦殼中蝦青素提取工藝進(jìn)行研究，得到了最佳提取條件是料液比為1∶5g/mL，提取溫度為30℃，提取時間為7h，提取級數(shù)為2級。此條件下蝦青素提取率為131.56μg/g(濕重)。本實驗采用二氯甲烷溶劑直接萃取法，方法簡單，設(shè)備要求低，而且有機(jī)溶劑可以有效的回收利用，比較適合于工業(yè)化生產(chǎn)，通過實驗得到了一個較為理想的提取蝦青素模型，為蝦青素的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

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