腹瀉性貝類毒素（DSP）的兩種快速檢測方法比較

胡雪蓮，俞漪，曲勤鳳，顧文佳

（上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術(shù)研究院，上海 200233）

貝類毒素（Shellfish toxin）是一類由浮游藻類或微生物合成，通過食物鏈傳給貝類，并在其體內(nèi)富集而形成的脂溶性次生代謝生物高分子化合物[1-3]。它的形成與海洋中有毒藻類赤潮密切相關(guān)。常見的貝類毒素包括腹瀉性貝類毒素（DSP）、麻痹性貝類毒素（PSP）、神經(jīng)性貝類毒素（NSP）和健忘性貝類毒素（ASP）等。其中，腹瀉性貝類毒素的存在比較普遍，海產(chǎn)雙殼類、棘皮類、腹足類等軟體動物中都曾有檢出該毒素的報道[4]。近年來對中國沿海部分海域貝類毒素的調(diào)查顯示[5-7]，中國沿海部分海域赤潮活動平凡，赤潮一旦產(chǎn)生，海產(chǎn)雙殼貝類易受到貝類毒素的威脅。腹瀉性貝類毒素的主要中毒癥狀包括腹瀉（92%）、惡心（80%）、嘔吐（79%）、下腹疼痛（53%）[8]。盡管目前還沒有因DSP中毒致死的報道，但由于DSP中毒癥狀與細菌性胃腸炎類似，極易混淆，且發(fā)作時間短，目前尚無有效的治療藥物，若是延誤治療，會對健康造成較大的傷害。

目前國內(nèi)外對于DSP的檢測方法以經(jīng)典的小鼠法為主，該方法是AOAC（美國官方化學(xué)家協(xié)會）的標(biāo)準(zhǔn)方法，同時也是目前唯一被大多數(shù)國家所普遍接受的統(tǒng)一方法。我國國標(biāo)GB/T 18406.4-2001《農(nóng)產(chǎn)品安全質(zhì)量無公害水產(chǎn)品安全要求》及2011年5月17日我國衛(wèi)生部剛公布的《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)貝類中腹瀉性貝類毒素的測定》（征求意見稿）中的檢測方法也都是小鼠法。但該方法存在著很多不足和缺陷，如：僅能指出毒性的大小，無法確定毒素的組成和含量；所測得的毒性和小鼠品系有關(guān)，可比性較差，必須進行標(biāo)準(zhǔn)毒素校準(zhǔn)才有可能相比；毒性測試所需時間長，重復(fù)性差；需要受過專門訓(xùn)練的操作人員；小鼠維持費用較高，對實驗場地要求較高等[9]。這些不足使得人們希望能有另外一些操作簡便、可比性強、易于普及、對實驗人員和檢測場地要求相對較低的檢測手段來替代小鼠法。

本文在前期研究的基礎(chǔ)上[10]，著重比較了兩種貝類毒素DSP的快速篩選檢測方法——酶聯(lián)免疫法和蛋白磷酸酶抑制法，旨在較短時間內(nèi)對貝類樣品中是否含有DSP進行快速篩查，以滿足當(dāng)前食品安全實時監(jiān)控的需要。

1 材料與方法

高純度DSP單標(biāo)OA標(biāo)準(zhǔn)溶液購自瑞士ALEXIS公司，質(zhì)量為50 μg。將OA標(biāo)準(zhǔn)品以1 mL 100%甲醇（分析純）溶解，制成OA母液并分裝，－18℃保存待用。使用時，將母液以1 mL 100%甲醇（分析純）稀釋成OA 濃度為 2 μmol/L（約 1 610 ppb）的中間液，作為標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液及加標(biāo)添加液。

用100%甲醇（分析純）將上述母液配制成濃度分別為 80、100、160、200、240、300 μg/kg 的 OA 標(biāo)準(zhǔn)液，分別以酶聯(lián)免疫法及蛋白磷酸酶抑制法進行檢測，每個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)檢測3次。以市售新鮮海產(chǎn)貝類為基質(zhì)，將貝類洗凈后去除貝殼，取出所有組織。用濾紙吸干貝肉上的水分，充分搗碎混勻，5.0 g/管分裝至50 mL離心管并高溫滅活。向離心管中添加OA標(biāo)準(zhǔn)品添加液，使 OA 終濃度分別為 80、100、120、140、160、200、240、300 μg/kg，分別以酶聯(lián)免疫法及蛋白磷酸酶抑制法進行檢測。每個模擬樣品重復(fù)檢測5次。

蛋白磷酸酶抑制法檢測選用TOXINLINE－DSP腹瀉性貝類毒素試劑盒（上海千慕生物科技有限公司），樣品前處理及檢測步驟勻按照試劑盒使用說明書進行。使用TECAN M200型全波長多功能微孔板分析系統(tǒng)進行讀數(shù)，激發(fā)波長（360±15）nm，發(fā)射波長（455±20）nm。以試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品OA濃度的對數(shù)值為X軸，熒光讀數(shù)值為Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出所測樣品中的OA含量。

酶聯(lián)免疫法檢測選用ABRAXIS OKADAIC ACID（DSP）ELISA試劑盒，使用TECAN M200型全波長多功能微孔板分析系統(tǒng)于450 nm處進行讀數(shù)。以試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品OA濃度為X軸，試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品BX與第一個標(biāo)準(zhǔn)品B0的百分比吸光度值B/B0（%）為Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出所測樣品中的OA含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 篩選檢出限的提出

腹瀉性貝類毒素是一類成分十分復(fù)雜的聚醚類或大環(huán)內(nèi)酯類化合物，一般可分為：酸性成分OA（大田軟海綿酸）及其天然衍生物DTX 1～3；中性成分聚醚內(nèi)酯（PTXs）；其它成分，如 YTX 等[1－3]。目前已經(jīng)證實與腹瀉有關(guān)的組分是其中的酸性成分OA及其衍生物DTX－1和DTX－3[3]。因此，選擇OA作為腹瀉性毒素的標(biāo)準(zhǔn)溶液進行加標(biāo)回收或制備模擬染毒樣品具有較強的代表性。

目前已有13個國家或組織制定了貝類中DSP的限量標(biāo)準(zhǔn)，各國對于DSP的限量標(biāo)準(zhǔn)多數(shù)基于OA及其衍生物的小鼠i.v.LD50和i.p.LD99量而制定。如FDA、日本、加拿大、澳大利亞、新西蘭、朝鮮等制定的DSP 限量為 20 μg/100 g（200 μg/kg）；EU、德國、葡萄牙、愛爾蘭、英國等制定的DSP中主要毒性成分OA限量為 16 μg/100 g（160 μg/kg）[11]。我國 GB/T 18406.4－2001《農(nóng)產(chǎn)品安全質(zhì)量無公害水產(chǎn)品安全要求》規(guī)定DSP的限量為 60 μg/100 g（600 μg/kg）。參考國內(nèi)外對貝類中DSP的限量要求，并考慮到本文所涉及兩種方法的實際檢出限以及該兩種方法主要應(yīng)用于篩選檢測的特點，將貝類產(chǎn)品中DSP的陽性檢出限暫定為200 μg/kg。即將篩查結(jié)果低于200 μg/kg的樣品視為DSP陰性，而檢測結(jié)果高于這一數(shù)值的樣品視為可疑陽性。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測結(jié)果

配制一系列不同濃度的OA標(biāo)準(zhǔn)液，使用上述所述兩種方法進行檢測。結(jié)果如表1、表2所示。

表1 蛋白磷酸酶抑制法對OA標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測結(jié)果Table 1 The dictation result of OA standard solution by protein phosphatase inhibition assay

由表1、表2可見，分別使用蛋白磷酸酶抑制法和酶聯(lián)免疫法對同一濃度的OA標(biāo)準(zhǔn)溶液進行三次測試，結(jié)果具有較好的重復(fù)性。檢測所得出的判定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度一致，即：標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度≥200 μg/kg的，檢測結(jié)果均為陽性；標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度低于200 μg/kg的，檢測結(jié)果為陰性，未出現(xiàn)陰陽性顛倒錯判的情況。三次檢測平均值與實際濃度之間的誤差在±13%之間，即本方法的檢測準(zhǔn)確率高于85%。當(dāng)OA濃度在200 μg/kg附近時，判定結(jié)果可能出現(xiàn)假陰性或假陽性的情況。

表2 酶聯(lián)免疫法對OA標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測結(jié)果Table 2 The dictation result of OA standard solution by ELISA assay

2.3 模擬陽性樣品檢測結(jié)果

考慮到實際檢測的對象為貝類樣品，標(biāo)準(zhǔn)溶液與實物貝類樣品可能會有一定差異。因此選用市售貽貝貝肉，經(jīng)高溫滅活后添加OA標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成不同濃度的模擬陽性樣品，使用上述所述兩種方法進行檢測。結(jié)果如表3、表4所示。

表3 蛋白磷酸酶抑制法對模擬陽性樣品檢測結(jié)果Table 3 The dictation result of man-made poisonous samples by protein phosphatase inhibition assay

表4 酶聯(lián)免疫法對模擬陽性樣品檢測結(jié)果Table 4 The dictation result of man-made poisonous samples by ELISA assay

由表3、表4可見，分別使用蛋白磷酸酶抑制法和酶聯(lián)免疫法對同一濃度的模擬陽性樣品重復(fù)5次檢測，結(jié)果顯示了良好的重復(fù)性。兩種方法的檢測的平均加標(biāo)回收率在±14%之間。檢測的陰陽性判定結(jié)果與加標(biāo)情況相一致，即：加標(biāo)濃度在200 μg/kg及以上的，檢測結(jié)果均為陽性；加標(biāo)濃度低于200 μg/kg的，檢測結(jié)果為陰性，未出現(xiàn)陰陽性顛倒錯判的情況。

以3種不同市售貝類為基質(zhì)，經(jīng)滅活處理后，制成OA濃度為100、240 μg/kg的模擬樣品，分別交由3名檢驗人員在盲樣的情況下使用蛋白磷酸酶抑制法和酶聯(lián)免疫法分別進行檢測。結(jié)果如表5、6所示。

由表5、表6可見，兩種方法對3種盲樣樣品的檢測結(jié)果均顯示出良好的重復(fù)性與較高的回收率。在因陽性判斷方面，3名檢驗人員的檢測結(jié)果完全一致，即：對于加標(biāo)濃度為100 μg/kg的樣品，判定結(jié)果均為陰性；加標(biāo)濃度為240 μg/kg的樣品，判定結(jié)果均為陽性。此結(jié)果證明，對于DSP含量明顯高于或低于篩選檢出限（200 μg/kg）的樣品，無論使用蛋白磷酸酶抑制法或是酶聯(lián)免疫法檢測，判定結(jié)果都是完全正確的。

綜合表1～表6的結(jié)果顯示，使用蛋白磷酸酶抑制法和酶聯(lián)免疫法都可以對樣品中是否含有腹瀉性貝類毒素（DSP）進行定性檢測，并可對樣品中貝類毒素的大致含量進行測定。這兩種方法的判定準(zhǔn)確率高，僅當(dāng)DSP濃度在（200±20）μg/kg時，才有可能出現(xiàn)假陰性或假陽性，因此都不失為行之有效的快速篩選方法。使用這兩種篩選方法，以200 μg/kg為陽性篩選檢出限，可以做到將大批量的樣品快速篩查，檢測結(jié)果≤200 μg/kg的樣品，可直接判定為DSP陰性；而檢測結(jié)果＞200 μg/kg的樣品應(yīng)判定為DSP可疑陽性，顯示該水產(chǎn)品可能受到腹瀉性貝類毒素DSP的污染。這樣，就可以在盡可能短的時間內(nèi)排除絕大部分的陰性樣品，并篩選出可能受到污染的可疑陽性樣品，送交有條件的實驗室用其他方法進行進一步確認。從而在最大范圍內(nèi)節(jié)省檢測時間與人力成本，提高檢測效率。

2.4 檢驗原理及優(yōu)勢比較

蛋白磷酸酶抑制法檢測腹瀉性貝類毒素DSP的基本原理是：蛋白磷酸酶可以水解為一種特殊的酶作用物并產(chǎn)生熒光反應(yīng)，而DSP毒素的主要活性成分OA、DTX是蛋白磷酸酶的有效抑制劑[12]，能不同程度地抑制磷酸酶的活性，其抑制程度與含量相關(guān)。由于該檢測原理基于DSP的生物毒性機理，測定的是DSP中的毒性活性成分總量，能較真實地反映出樣品的毒性大小，檢測所產(chǎn)生的假陽性率低。值得指出的是，有研究表明，有些種類的貝類中可能含有某種成分能降低DSP的水解效率，使得本檢驗方法未必適合所有的貝類樣品[13]。就檢測時間與成本而言，使用商業(yè)試劑盒，蛋白磷酸酶抑制法對于單個樣品的檢測時間低于4 h，每個樣品的檢測成本為150元左右。但檢測中所使用的磷酸酶、底物等試劑均為一次性現(xiàn)配現(xiàn)用，從某種程度上提高了該方法的檢測成本。此外，該檢測方法需要用到價格昂貴的熒光酶標(biāo)儀（全波長多功能微孔板分析系統(tǒng)），這也限制了該方法在基層檢驗機構(gòu)的開展。

酶聯(lián)免疫法檢測DSP的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)，微孔板包被有針對DSP抗體的捕捉抗體，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品提取液及DSP酶標(biāo)記物，游離DSP與DSP標(biāo)記物競爭DSP抗體，同時DSP抗體與捕捉抗體連接。再經(jīng)洗滌、發(fā)色、孵育顯色等步驟，最后于450 nm處測量樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進行定量計算。目前，只有OA有商用的配套系列試劑盒出售，所采用的抗體僅與OA反應(yīng)，但不與其他毒物如DTX、PTX、YTX反應(yīng)，因此專一性較強。酶聯(lián)免疫法適用于所有的貝類樣品。該方法的檢測時間為4 h～6 h，單個樣品的檢測成本低于100元，且對檢測儀器要求較低。但由于方法的局限性，在實際檢測過程中，檢驗結(jié)果易受到樣品基質(zhì)的影響而產(chǎn)生較多的假陽性。

3 結(jié)論

綜上所述，使用蛋白磷酸酶抑制法及酶聯(lián)免疫法可以對樣品中是否含有腹瀉性貝類毒素（DSP）進行定性檢測，并可以對樣品中貝類毒素的大致含量進行測定。與傳統(tǒng)的小鼠法相比，這兩種方法都具有耗時較短，重復(fù)性較好的優(yōu)點。本文所提出的陽性篩選檢出限（200 μg/kg）遠低于我國相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定（600 μg/kg），說明該二方法均可作為較理想的篩選方法，在盡可能短的時間內(nèi)排除絕大部分的陰性樣品，并篩選出可能受到污染的可疑陽性樣品，可以用于滿足世博會等重大場合對食品安全保障的需求。此外，由于天然含腹瀉性貝類毒素DSP樣品不易獲得，缺乏由天然陽性樣品中得出的檢測數(shù)據(jù)，還需要在后期檢測過程中對本檢測方法進行完善與補充。

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