HCV分型研究進(jìn)展

李 媛，馮 悅，夏雪山，胡學(xué)偉

(昆明理工大學(xué)，昆明 650500)

目前丙型肝炎病毒(HCV)感染已成為世界性的公共衛(wèi)生難題，威脅著人類健康。HCV全球感染人數(shù)接近1.7億，且以每年新增300萬的速度增長，具有流行面廣、發(fā)病率高的特點，并與慢性肝病、肝硬化、肝癌等疾病密切相關(guān)［1］。該病毒自1989年首次鑒定以來，經(jīng)過20多年的研究，對其病毒學(xué)等方面的特征已有了較深入的認(rèn)識。HCV是單股正鏈的 RNA 病毒，基因組全長約為 9.6 kb［2］。目前，針對HCV通常使用的治療方法是聚乙二醇干擾素-ɑ(Peg-IFN-ɑ，)聯(lián)合利巴韋林(RBV)，但該方法并非對所有的丙型肝炎(丙肝)患者都有理想的療效，其中，HCV的基因型及基因亞型是影響療效的一個主要因素［1，3］。不同的HCV基因型或亞型對肝臟的損傷情況不同，對干擾素的敏感性也有差異，因而在疾病進(jìn)程、治療等方面不能從一而論。目前已發(fā)現(xiàn)的的 HCV 基因型有6 種，基因亞型 80 余種［4，5］，并且新的基因型和亞型仍在不斷報道中［6～9］。本文現(xiàn)就目前HCV分型研究中常用的方法、分型區(qū)段作一綜述。

1 HCV分型常用方法

目前HCV分型中常采用的方法有如下幾類:多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)及相關(guān)衍生方法、血清學(xué)方法、基因芯片法等。

1.1 PCR及相關(guān)衍生方法 PCR法因其能對微量核酸進(jìn)行指數(shù)倍擴(kuò)增，并最終獲得檢測結(jié)果，又具有相對快速、高效的特點，得到廣泛應(yīng)用。PCR依賴的序列分析法主要是通過對病毒基因組全長序列或部分序列的測定比對及分析，發(fā)現(xiàn)其不同特點，從而進(jìn)行基因型或亞型的確定。在基本PCR方法的基礎(chǔ)上，又衍生出了實時熒光定量 PCR(real-time PCR)、巢式PCR(nested-PCR)、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)等方法。

1.1.1 實時熒光定量PCR法 指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記物，通過對熒光信號的捕獲實現(xiàn)對擴(kuò)增過程的觀察和監(jiān)測的一種方法。熒光靈敏度好，效率高，能做定量分析，減少實驗步驟，結(jié)果重現(xiàn)性好。郭新會等［10］研究認(rèn)為實時熒光定量PCR在敏感性、特異性、重復(fù)性和便捷性等方面均優(yōu)于直接測序法。但該方法需要專門的熒光定量PCR儀及配套試劑，實驗成本較高。

1.1.2 巢式PCR法 巢式PCR是常規(guī)PCR的一種變異形式，其使用兩對PCR引物擴(kuò)增片段，第一對PCR引物擴(kuò)增片段與普通PCR相似，第二對引物為巢式引物，結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)，經(jīng)歷兩個PCR程序，擴(kuò)增特異性增強(qiáng)，靈敏度與可靠性優(yōu)于普通PCR，常用于低濃度的核酸擴(kuò)增。王曉忠等［11］用巢式PCR法結(jié)合其他方法分析了新疆地區(qū)少數(shù)民族靜脈吸毒者中HCV感染者的病毒基因型，鑒定出HCV1型是該人群中的流行優(yōu)勢型別。

1.1.3 RFLP法 該方法通過提取及擴(kuò)增靶基因，利用限制性酶切位點間的插入、缺失、重排、突變等原因而造成的基因型間限制性片段長度的變異，進(jìn)行適當(dāng)?shù)拿盖泻髲奶禺愋缘碾娪緢D譜觀察其多態(tài)性，借以區(qū)分不同基因型。在HCV分型檢測中，RFLP法主要針對5'UTR區(qū)進(jìn)行。邱國華等針對5'UTR區(qū)擴(kuò)增后，采用 BHH'(BsrBⅠ、HaeⅡ、HinfⅠ)復(fù)合內(nèi)切酶、BstUⅠ內(nèi)切酶及HaeⅢ內(nèi)切酶對93份HCV RNA的PCR產(chǎn)物依次進(jìn)行酶切消化，完成了 HCV1a、1b、2a、2b、3a、3b、4a、6a 的鑒別，獲得良好的分型效果［12，13］。因 5'UTR 區(qū)比較保守，故RFLP法敏感性較高，能同時鑒別出多個型別，減輕了工作量，適合于大規(guī)模的篩查。目前該法已能正確能檢出HCV1～6型基因型，還能區(qū)分HCV1b、2a、2b、3a、3b 等亞型［1］。但 RFLP 法穩(wěn)定性較差，重復(fù)性較低。

此外，還存在其他PCR衍生方法，但在HCV分型中應(yīng)用較多且效果較好的主要為以上幾類。實際操作中常常存在多種方法聯(lián)合運(yùn)用、相互驗證的情況。如王敏等［14］聯(lián)合熒光定量PCR法和巢式PCR法探討了廣州地區(qū)無償獻(xiàn)血人群HCV的基因型分布情況。

1.2 血清學(xué)方法 血清學(xué)方法是一種經(jīng)典的病毒性疾病診斷方法，目前常用于HCV分型檢測的為多肽ELISA、重組抗原ELISA等，它們的敏感性、準(zhǔn)確性較高，經(jīng)過對HCV RNA的C區(qū)、NS4區(qū)、NS5區(qū)等區(qū)段進(jìn)行檢測，已經(jīng)能區(qū)分HCV1～6型，與PCR等分子生物學(xué)方法基因分型的相符率能達(dá)到95%以上［1］。陳青鋒等［15］對168例樣本進(jìn)行血清分型和基因分型相關(guān)性的研究，發(fā)現(xiàn)二者的符合率可達(dá)96.7%。血清學(xué)方法快捷簡便，成本低，臨床應(yīng)用廣泛，但當(dāng)出現(xiàn)病毒混合感染或病毒變異時難以區(qū)分。

1.3 基因芯片法 基因芯片是將大量特定的基因片段固定或附著于經(jīng)過特殊處理的膜、玻片等支持物上，然后通過雜交、掃描、檢測、分析等步驟，得到所需要的信息。目前利用基因芯片技術(shù)已能對HCV的6個基因型和10余個亞型成功進(jìn)行分型［16］。毛紅菊等［17］采用基因芯片法檢測丙肝患者HCV的基因型，并通過測序結(jié)果進(jìn)行驗證，二者完全一致?；蛐酒峡梢耘帕写罅坎煌悇e的探針以滿足不同需要，例如聯(lián)合HCV的5'UTR區(qū)和C區(qū)可提高分辨力，擴(kuò)大分型范圍。運(yùn)用基因芯片這一性質(zhì)，有望同時對多種病毒進(jìn)行檢測分型。該法具有靈敏、高通量、集約化、規(guī)?；⒔Y(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點［17］，但因其技術(shù)要求高、制作復(fù)雜，在推廣上還受到一些限制。

常用HCV分型方法的優(yōu)缺點見表1。

表1 常用HCV分型方法的優(yōu)缺點

2 HCV分型常用區(qū)段

HCV的分型方法有多種，分型的靶區(qū)段也有多個。HCV基因組由兩端兩個非編碼區(qū)(UTR)和中間的一個開放閱讀框(ORF)組成。ORF區(qū)又依次分為 C區(qū)、E1區(qū)、E2區(qū)、NS1區(qū)、NS2區(qū)、NS3區(qū)、NS4A區(qū)、NS4B區(qū)、NS5A區(qū)和NS5B區(qū)。兩個UTR(即5'UTR和3'UTR)是HCV基因組中最保守的區(qū)域，而 E1 區(qū)和 E2 區(qū)則是變異率最高的區(qū)域［1，4，5］。其中NS5B區(qū)、C區(qū)、E1區(qū)是目前較常用的分型區(qū)段。

2.1 NS5B區(qū) NS5B區(qū)位于HCV基因組7602～9371位點之間，是一段相對保守的區(qū)域。Martro等［18］通過解讀NS5B片段信息，分析了3例來自于Barcelona地區(qū)的HCV樣本，確定其為一種較為罕見的HCV亞型——2q亞型。萬祥輝等［19］從 Genbank中篩選了多條信息完整、有注釋的來自于不同國家和地區(qū)的HCV全基因組序列，在系統(tǒng)進(jìn)化樹重建原理基礎(chǔ)上，對不同的區(qū)段分型效果進(jìn)行比較，認(rèn)為NS5B能代表HCV全基因組序列的情況，最能反映HCV毒株的演化關(guān)系，是分型的最佳區(qū)域。Murphy等［20］也曾展開NS5B區(qū)段的序列分析，認(rèn)為通過NS5B區(qū)域的分析，能對HCV進(jìn)行有效的基因分型。

2.2 C區(qū) C區(qū)是指HCV基因組342～914位點間的片段，長度為573位點，是高度保守的區(qū)段。Simmonds等［21］研究了C區(qū)中15～384位點間的序列，認(rèn)為基因型間的序列相似度為81% ～88%，而亞型的相似度在88% ～93%。Okamoto等［22］通過研究44個HCV樣本的C區(qū)序列，劃分出了4個HCV基因型。

2.3 E1區(qū) E1區(qū)位于HCV基因組915～1490位點，長度為576位點，是HCV基因組內(nèi)變異率最高的區(qū)域之一，其高變異率是HCV在感染者體內(nèi)呈現(xiàn)準(zhǔn)種分布的原因之一，也是HCV分型常用的靶區(qū)段。Simmonds等［21］曾對HCV基因型鑒定中NS-5、E1區(qū)的序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)E1區(qū)的分型結(jié)果與NS-5區(qū)在HCV的6個主要基因型和一系列亞型上十分吻合，認(rèn)為E1區(qū)和NS-5區(qū)已包含了足夠的系統(tǒng)信息來鑒定已知的HCV基因型或亞型。

NS5B區(qū)、C區(qū)、E1區(qū)及其他區(qū)段(如5'UTR)常被聯(lián)合應(yīng)用于HCV分型的檢測［23］。Xia等聯(lián)合NS5B區(qū)域和5'NCR-C區(qū)進(jìn)行研究，在HCV/HIV-1共感染的靜脈吸毒患者中，發(fā)現(xiàn)了HCV新的基因亞型和基因型的新分布［7］。

3 問題與展望

Simmond等曾對HCV分型情況做了總結(jié)，并對HCV基因型和基因亞型尤其是新基因型和新亞型的確定提出建議:新確立的基因型需要在現(xiàn)有基因型的分類基礎(chǔ)上較恒定地保持獨(dú)立性，應(yīng)運(yùn)用多種方法對編碼區(qū)全序列及特定區(qū)域如C/E1/NS5B區(qū)進(jìn)行系統(tǒng)分析，并確認(rèn)病毒無重組發(fā)生;新亞型的提出需注重其流行病學(xué)意義，同一個基因型中的不同亞型，序列間差異需大于15%［4］。但在實際研究中，HCV的高變異率往往導(dǎo)致HCV的分型面臨一些復(fù)雜局面，如Lu等的研究顯示，在HCV6型中，有一些毒株在亞型內(nèi)的遺傳距離大于亞型間的遺傳距離，這給分型判定帶來了一定的困擾［8］。除了通過序列分析發(fā)現(xiàn)新的基因型、基因亞型外，藥物治療的無效位點也可能有助于發(fā)現(xiàn)新基因型［23］。未來有望通過建立病毒體外培養(yǎng)體系等方式，從分子機(jī)制上探索HCV不同基因型間的的感染差異和傳播行為，最終為丙肝的控制、治療等的研究和實踐提供依據(jù)。

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