中國(guó)人群中VEGF基因啟動(dòng)子區(qū)-460T/C與-634G/C單倍型與結(jié)腸癌的易感性研究

張 瑩 孫秀靜 朱圣韜

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院消化內(nèi)科，北京100050;2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院消化內(nèi)科，北京100050)

血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)基因定位于人染色體6p21.3，其編碼的蛋白由2條類(lèi)似的肽鏈組成的糖蛋白二聚體所構(gòu)成。目前對(duì)腫瘤的研究［1］表明，VEGF能夠特異性地刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增生、促進(jìn)其遷移，并參與新生血管的形成，也是目前已知的最強(qiáng)血管生成因子和內(nèi)皮細(xì)胞選擇性促有絲分裂因子，因而被認(rèn)為是與惡性腫瘤新生血管形成、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增生聯(lián)系最緊密的一個(gè)細(xì)胞因子。當(dāng)前在對(duì)于惡性腫瘤的研究中，肺癌、宮頸癌、胃癌、以及腎細(xì)胞癌等的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)與VEGF的基因多態(tài)性密切相關(guān)［2-5］，但截止到目前，尚未有研究涉及VEGF基因多態(tài)性、尤其是單倍型與結(jié)腸癌易感性關(guān)聯(lián)報(bào)道。在以往基因功能表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究［6］中，已證實(shí)VEGF基因中存在若干個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，其中一些多態(tài)性位點(diǎn)的改變能夠調(diào)節(jié)或者改變VEGF基因的蛋白表達(dá)。本研究采用病例-對(duì)照研究方法，運(yùn)用PCR-RFLP技術(shù)檢測(cè)VEGF基因啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性并構(gòu)建其單倍型，擬探討VEGF基因啟動(dòng)子區(qū)域-460(NCBI dbSNP rs833061)與-634(NCBI db-SNP rs2010963)多態(tài)性位點(diǎn)的單倍型在中國(guó)漢族人群中的分布，以及VEGF基因單倍型對(duì)結(jié)腸癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的易感關(guān)聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 病例與對(duì)照的選擇

病例組選自2007年3月至2011年3月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院和附屬北京友誼醫(yī)院消化內(nèi)科保存的臨床病例資料中完整的結(jié)腸癌患者的血液樣本共182例，其中男98例，女84例，平均年齡(55.13±10.26)歲。病例中腺癌125例，黏液癌38例、未分化癌19例;根據(jù)病理學(xué)診斷以及患者相應(yīng)的輔助檢查確定病例組結(jié)腸癌患者的TNM分期，其中Ⅰ-Ⅱ期患者 97 例(47/182，53.30%)，Ⅲ-Ⅳ患者例85(85/182，46.70%);遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者(M1)總計(jì)51例(51/182，28.02%)。入選標(biāo)準(zhǔn):所有患者在血液標(biāo)本采集前均未有輸全血或其他成分輸血記錄，每例患者均經(jīng)術(shù)后或內(nèi)鏡下組織病理學(xué)確診;剔除標(biāo)準(zhǔn):患者合并有第二原發(fā)惡性腫瘤或其他自身免疫系統(tǒng)疾病。對(duì)照組選自首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院和附屬北京友誼醫(yī)院體檢中心的健康人群血液樣本，年齡與性別等均和病例組相匹配;對(duì)照組中男117例，女99例，平均年齡(56.91±8.54)歲，共216例。兩組人群中個(gè)體之間均無(wú)血緣關(guān)系，均系中國(guó)漢族人群。

1.2 基因組DNA抽提

每位研究個(gè)體均采集用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝的靜脈全血2 mL，在蛋白酶K消化之后采用苯酚/氯仿提取全血基因組DNA，總計(jì)提取結(jié)腸癌患者、健康正常人外周血DNA 398例，提取的基因組DNA溶解于TE中，并保存于-80℃冰箱。

1.3 多態(tài)性位點(diǎn)的選擇及引物設(shè)計(jì)

在Gene Bank中檢索到VEGF基因的全長(zhǎng)序列(GenBank Accession number:AF 095785.1)，并參考國(guó)外有關(guān)文獻(xiàn)［7］進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)與合成，本研究引物由上海申友生物技術(shù)有限公司合成。-460T/C位點(diǎn):forward-CCTCTTTAGCCAGAGCCGGGG，Reverse-TGGCCTTCTCCCCGCTCCAAC;-634G/C位點(diǎn):forward-TTGCTTGCCATTCCCCACTTG，Reverse-CCGAAGCGAG AACAGCCCAGAA。

1.4 PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件

PCR擴(kuò)增體系及程序如下:ddH2O 40.5 μL，10×PCR 緩沖液(含 1.5 mmol/L Mg2+)5 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，Taq 酶 5 U(Promega Company，USA)，上、下游引物各 1 μL(20 μmol/L)，DNA 模板 1 μL(500 ng)。擴(kuò)增采用程序:94℃預(yù)變性2 min后，94℃變性40 s，退火40 s，退火溫度分別為60.0℃(-460T/C)、54.5 ℃(-634G/C)，之后72 ℃延伸40 s，共35個(gè)循環(huán)，最后在72℃條件下延伸10 min(PE Biosystems，USA)。PCR產(chǎn)物的純化采用Millipore公司的Multiscreen-PCR純化板進(jìn)行純化(Millipore Company，USA)。

1.5 RFLP方法檢測(cè)-460T/C與-634G/C位點(diǎn)基因型

PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，分別采用限制性?xún)?nèi)切酶Bsa-HI和 BsmFI(New England Biolabs Beverly，Ma，USA)對(duì)-460T/C、-634G/C這兩個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行酶切基因分型。每個(gè)反應(yīng)體系為20 μL，其中 DNA 約1 μg、內(nèi)切酶5 U、加各自?xún)?nèi)切酶相應(yīng)的10×Buffer 2 μL、最后加ddH2O至20 μL;根據(jù)NEB公司操作手冊(cè)BsaHI內(nèi)切酶水浴溫度為37℃、BsmFI內(nèi)切酶水浴溫度為65℃，水浴時(shí)間均為12 h過(guò)夜。酶切結(jié)束后立即進(jìn)行瓊脂糖電泳并進(jìn)行EB染色，在凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)判斷每一個(gè)體-460T/C與-634G/C位點(diǎn)的基因型(Agarose-1000;Gibco BRL，USA，使用濃度為 2%)。

1.6 -460T/C與-634G/C多態(tài)性位點(diǎn)的單倍型構(gòu)建

基于-460T/C與-634G/C兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)均位于VEGF基因啟動(dòng)子區(qū)域，并且相互毗鄰，故對(duì)兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)在398個(gè)體中的基因型，采用以Bayes-ian algorithm(貝葉斯算法)為基礎(chǔ)的 PHASE軟件(PHASE 1.0)進(jìn)行逐個(gè)個(gè)體單倍體的構(gòu)建［8］。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件SPSS 13.0(SPSS 13.0 for Windows，Chicago，IL)，利用 Chi-square Test驗(yàn)證基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg平衡定律，并檢驗(yàn)兩組之間性別、吸煙、飲酒、腫瘤家族史、等位基因位點(diǎn)等的分布差異;利用Mann Whitney-U檢驗(yàn)比較兩組人群之間年齡分布的差異;以O(shè)R值(odds ratio)及其95%CI(confidence intervals)甄別多態(tài)性、單倍型與結(jié)腸癌風(fēng)險(xiǎn)之間的相關(guān)性;選擇非條件Logistic回歸模型統(tǒng)計(jì)分析OR值及95%CI，其結(jié)果均經(jīng)年齡、性別、吸煙、飲酒、腫瘤家族史等混雜因素校正后取得;所有的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)概率檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)

統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明兩組人群之間顯示良好的匹配性，Mann Whitney-U方法比較兩組之間年齡分布的差異(P=0.086)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;在病例與對(duì)照組的統(tǒng)計(jì)分析中，Chi-square Test檢驗(yàn)結(jié)果顯示性別、吸煙、飲酒等差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);而在腫瘤家族史的對(duì)比結(jié)果提示，結(jié)腸癌患者中其家族腫瘤史顯著高于正常對(duì)照組(P=0.001)(表1)，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 病例與對(duì)照組的一般資料Tab.1 Characteristics of the colorectal cancer patients and normal controls n(%)

2.2 -460T/C與-634G/C位點(diǎn)多態(tài)性與結(jié)腸癌的關(guān)聯(lián)分析

182例結(jié)腸癌患者與216例健康對(duì)照人群中，兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)經(jīng)PCR-RFLP檢測(cè)后結(jié)果顯示VEGF基因-460T/C與-634G/C位點(diǎn)的多態(tài)性在我們檢測(cè)的樣本中均存在;同時(shí)分別進(jìn)行兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)各自的3種基因型數(shù)據(jù)讀取與統(tǒng)計(jì)(圖1)，等位基因的頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P＞0.05)。

圖1 VEGF基因啟動(dòng)子區(qū)域-460與-634多態(tài)性位點(diǎn)凝膠成像圖Fig.1 Product of the VEGF-460 and VEGF-634 polymorphisms in the promoter region of the VEGF gene shown on agarose electrophoresis

VEGF基因中-460T/C多態(tài)性位點(diǎn)在檢測(cè)的結(jié)腸癌患者與對(duì)照人群中，等位基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔P=0.002，OR=1.67(95%CI:1.33-4.72)〕;雜合型T/C較之野生純合型T/T在兩組人群中的頻率分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔P=0.021，OR=1.61(95%CI:2.39-9.75)〕;多態(tài)純合型C/C較之野生純合型T/T在兩組人群中的頻率分布也同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔P=0.001，OR=3.12(95%CI:5.82-11.74)〕。-634G/C位點(diǎn)多態(tài)性在正常人群與結(jié)腸癌患者之間等位基因頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.103);-634G/C多態(tài)性位點(diǎn)基因型頻率在兩組人群間差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義:雜合型(G/C P=0.082)，多態(tài)純合型(C/C P=0.051)，詳見(jiàn)表2。

2.3 -460T/C與-634G/C多態(tài)性位點(diǎn)單倍型頻率統(tǒng)計(jì)分析

-460T/C與-634G/C多態(tài)性位點(diǎn)在VEGF基因啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)相互毗鄰，針對(duì)病例與對(duì)照組中-460T/C與-634G/C基因多態(tài)性位點(diǎn)的基因型，本課題組利用PHASE1.0軟件進(jìn)行每個(gè)個(gè)體單倍體的構(gòu)建［8］，結(jié)果共有4種單倍體組合:A=T-G、B=T-C、C=C-G、D=C-C(表3);并對(duì)每個(gè)個(gè)體(總398例)逐一進(jìn)行了--/-- 、--/Haplotype、Haplotype/Haplotype 3種單倍型的統(tǒng)計(jì)，由于Haplotype/Haplotype純合單倍型出現(xiàn)的頻率相對(duì)較低，本課題組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析時(shí)將--/Haplotype、Haplotype/Haplotype合并。結(jié)果表明:前3種單倍型T-G、T-C、C-G在結(jié)腸癌患者與對(duì)照組人群之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為P=0.086，P=0.194，P=0.201);而單倍型C-C在結(jié)腸癌組與對(duì)照組人群之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔P＜0.001，OR=4.28(95%CI:2.77-13.41)(表3)〕。

表2 VEGF基因啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性與結(jié)腸癌的關(guān)聯(lián)分析Tab.2 The associated analysis between the colorectal cancer and VEGF gene promoter polymorphismsn(%)

3 討論

Ferrara于1989年從牛垂體濾泡星狀細(xì)胞體外培養(yǎng)液中分離純化的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，又稱(chēng)血管通透因子，是具有促血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂活性的糖基化多肽分泌因子。在惡性腫瘤的生長(zhǎng)過(guò)程中，其通過(guò)受體的作用促細(xì)胞增生作用體現(xiàn)于2個(gè)方面:一方面促進(jìn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞增生、分化、遷延，而從另一方面則能夠促使微血管形成與通透性增加，最終促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與遠(yuǎn)處遷移［9-10］。在VEGF促有絲分裂活性的分子機(jī)制中，2種高親和力酪氨酸激酶受體發(fā)揮著重要的生物學(xué)效應(yīng)，這2種受體即含激酶插入?yún)^(qū)受體(KDRPflk-1，VEGFR-2)和FMS-樣酪氨酸激酶-1(FLT-1，VEGFR-1)，兩者均為跨膜蛋白，與配體結(jié)合后形成二聚體，引發(fā)一系列的連鎖生化反應(yīng)［12-13］。

表3 VEGF基因啟動(dòng)子區(qū)-460T/C與-634G/C構(gòu)建的單倍型與結(jié)腸癌的關(guān)聯(lián)分析Tab.3 Association analyses of the colorectal cancer and the haplotypes constituted by the-460T/C and-634G/C polymorphisms of VEGF gene promoter n(%)

結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展不僅具有家族聚集性和明顯的個(gè)體差異，并且也是多因素、多基因變異累積的癌變過(guò)程。近期的一系列相關(guān)研究［14-15］認(rèn)為，在結(jié)腸癌的遺傳易感性方面，VEGF在血漿的表達(dá)水平高低是影響結(jié)腸癌易感性的重要環(huán)節(jié)，而VEGF基因的多態(tài)性的改變，將導(dǎo)致相應(yīng)的VEGF血漿水平表達(dá)水平或活性改變，從而引起對(duì)結(jié)腸癌易感性的個(gè)體化差異。

參與調(diào)節(jié)VEGF表達(dá)合成的因素較多，近年來(lái)的研究表明，VEGF基因多態(tài)性與其活性密切相關(guān)，Stevens A等［16］認(rèn)為攜帶有-460/+405多態(tài)性能夠顯著改變VEGF基因啟動(dòng)子的活性和反應(yīng)性，這種多態(tài)性的改變將導(dǎo)致啟動(dòng)子活性較野生型提高了71%。我們此次研究發(fā)現(xiàn):在182例結(jié)腸癌患者與216例對(duì)照的人群中，VEGF基因啟動(dòng)子區(qū)域-460T/C與-634G/C位點(diǎn)多態(tài)性在中國(guó)漢族人群中不僅普遍的存在，而且-460T/C多態(tài)性位點(diǎn)等位基因頻率在兩組人群中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)，其雜合型T/C及多態(tài)純合型C/C較之野生純合型T/T在兩組人群中的頻率分布差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);但-634G/C多態(tài)性位點(diǎn)在兩組人群之間差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。在研究疾病的遺傳易感因素當(dāng)中，對(duì)于疾病的發(fā)生與發(fā)展每一個(gè)SNP的存在并不只是起到一個(gè)孤立的作用，多個(gè)SNP之間存在著一定的內(nèi)在關(guān)聯(lián)與相互作用，單倍型則能夠更好地體現(xiàn)這種遺傳關(guān)聯(lián)，因此對(duì)于揭示多個(gè)SNPs與疾病的易感關(guān)聯(lián)，單倍型的研究是一種較好的手段［17］。由于VEGF基因啟動(dòng)子區(qū)域-460T/C與-634G/C多態(tài)性位點(diǎn)相互毗鄰，我們進(jìn)一步進(jìn)行了VEGF基因單倍型與結(jié)腸癌的關(guān)聯(lián)分析。研究結(jié)果顯示，兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)共構(gòu)建4種單倍體，其中-460位點(diǎn)C與-634位點(diǎn)C所組成的單倍型C-C在兩組人群中差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，表明具有單倍體C-C個(gè)體(與其他單倍體雜合或者本身純合存在時(shí))較之不含該單倍體的個(gè)體對(duì)于結(jié)腸癌的發(fā)生，能夠增加其4.28倍的罹患風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，VEGF基因啟動(dòng)子區(qū) -460T/C與-634G/C多態(tài)性位點(diǎn)所構(gòu)成的單倍型能夠影響著結(jié)腸癌的發(fā)生，成為結(jié)腸癌的易感風(fēng)險(xiǎn)因素;但關(guān)于該兩個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性以及單倍型如何調(diào)控VEGF的血漿水平表達(dá)狀況、以及如何參與結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究探討。

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