貴州香豬ACTB基因的克隆與序列分析

曹龍凱，郭春華*

（1.西南民族大學(xué)生命與技術(shù)學(xué)院，成都 610041；2.動物遺傳育種國家民委教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041）

肌動蛋白（β-actin，ACTB）是一種細(xì)胞質(zhì)肌動蛋白，是細(xì)胞骨架的重要組成部分，是最主要的非肌動蛋白或胞質(zhì)肌動蛋白異形體，在大多數(shù)非肌肉細(xì)胞以及未分化的成肌細(xì)胞中表達(dá)。肌動蛋白有6種不同的異構(gòu)體，根據(jù)等電點(diǎn)的不同，分為α、β、γ 3種。幾乎參與了真核細(xì)胞中所有的生理過程，如維持細(xì)胞骨架的完整、細(xì)胞分裂、細(xì)胞分化、染色體運(yùn)動、細(xì)胞器運(yùn)動、細(xì)胞流動等。從線蟲到人類，肌動蛋白在不同細(xì)胞中都有著數(shù)量高而穩(wěn)定的表達(dá)，魚類、兩棲類、鳥類、哺乳類等不同類群脊椎動物ACTB氨基酸序列同源性均在96%以上，表明ACTB基因的高度保守性[1-2]。此外，ACTB基因還具有高表達(dá)量，表達(dá)穩(wěn)定的特點(diǎn)，因此常被作為內(nèi)參基因[3]。

貴州香豬是中國本地豬的一種，是國家二級稀有動物，是醫(yī)用實(shí)驗(yàn)動物和加工高檔豬肉產(chǎn)品最佳材料，且具有很高的育種潛力。貴州香豬ACTB基因的研究少，本試驗(yàn)對其進(jìn)行了克隆和序列分析，為進(jìn)一步研究香豬ACTB基因的結(jié)構(gòu)和功能提供了理論依據(jù)，同時也為香豬其他功能基因的研究提供可靠的分子內(nèi)標(biāo)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 香豬

香豬購于貴州大學(xué)種豬場。

1.2 菌株及試劑

大腸桿菌DH5α、動物組織總RNA提取試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購自天根生化科技有限公司；DNA聚合酶（Ex taq）、PMD19-T載體試劑盒和MarkerⅢ購自寶生物工程有限責(zé)任公司；反轉(zhuǎn)錄酶（E6300S）購自NEB公司。

1.3 豬肌肉組織

隨機(jī)選取貴州香豬，宰殺后取其背最長?。ㄑ奂。┎课患∪饨M織凍存于液氮中。

2 試驗(yàn)方法

2.1 引物的設(shè)計與合成

參照GenBank上發(fā)表的野豬的ACTB基因的RNA序列（XM_003124280.2），采用Primer 6.0軟件設(shè)計一對引物，用來擴(kuò)增香豬的ACTB基因的CDS區(qū)，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

引物序列為：上游引物5′-ATGGATGACGAT ATTGCT-3′，下游引物5-CA′AGTATTAAGGCGAA?GA-3，PC′R產(chǎn)物全長1 596 bp，包含了ACTB基因的完整CDS區(qū)。

2.2 總RNA的提取

取約香豬肌肉組織20 mg，用液氮進(jìn)行研磨，待樣品被磨碎后，融化之前，迅速將其轉(zhuǎn)移到裝有裂解液（含有β-巰基乙醇）的2 mL EP管中，利用電動勻漿儀將其進(jìn)一步研碎，最后按照動物組織總RNA提取試劑盒提取總RNA，通過紫外分光光度儀來測定RNA的濃度。

2.3 PCR反應(yīng)

以香豬肌肉組織總RNA為模板，Oligo dT為反轉(zhuǎn)錄引物，參照NEB公司反轉(zhuǎn)錄酶（E6300S）說明書合成cDNA。以cDNA為模板，Ex taq聚合酶為PCR反應(yīng)酶，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為95℃5 min，5℃1 min，59℃1 min，72℃2 min，35個循環(huán)，72℃5 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2.4 PCR產(chǎn)物的克隆與測序

PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA回收試劑盒回收純化后，連接于PMD19-T克隆載體上，轉(zhuǎn)化到工程菌E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，培養(yǎng)于LB固體培養(yǎng)基（含Amp）中，通過藍(lán)白斑篩選，挑菌培養(yǎng)，最后菌液PCR鑒定目的基因。由上海英駿生物技術(shù)公司測序。

2.5 序列分析

運(yùn)用DNAMAN工具，將測序結(jié)果與GeneBank數(shù)據(jù)庫中公布的已知序列進(jìn)行同源性比對。并采用Clustal X、MEGA4.1軟件對測序結(jié)果進(jìn)行多序列比對分析及建立系統(tǒng)演化樹。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 總RNA提取結(jié)果

總RNA的提取結(jié)果見圖1。

圖1 RNA圖

由圖1可知，在16 s和28 s處清晰可見條帶，總RNA提取完整。

3.2 PCR擴(kuò)增的結(jié)果

PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖2。

圖2 PCR目的片段

由圖2可知，PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，在1 596 bp處可見目的條帶。

3.3 序列分析

序列分析見圖3。

由圖3可知，基因序列測定表明，克隆得到的ACTB序列長度為1 596 bp，包含了ACTB基因的全長CDS區(qū)，編碼一個由376個氨基酸組成的多肽，與GeneBank上發(fā)表的序列大小相符。

3.4 進(jìn)化樹分析

進(jìn)化樹分析見圖4。

圖3 香豬的ACTB基因cDNA序列及氨基酸序列

圖4 貴州香豬ACTB基因的系統(tǒng)演化樹

由圖4可知，貴州香豬ACTB基因與GeneBank上發(fā)表的野豬、山羊、牛、人和原雞的序列同源性分別為99.37%、95.56%、95.01%、93.88%和86.87%。序列登錄號分別為野豬ACTB基因（XM_003124280.2）、山羊ACTB基因（NM_001009784）、牛ACTB基因（NM_173979）、人的ACTB基因（NM_001101）和原雞ACTB基因（NM_205518.1）。其中與野豬同源性最高，與原雞的同源性最低，這與系統(tǒng)演化樹所說明的一致。

4 討論

本試驗(yàn)對貴州香豬ACTB基因的克隆，在國內(nèi)外是首次報道。目前ACTB基因的研究在節(jié)肢動物、軟體動物等方面有所報道[4-5]。ACTB基因編碼區(qū)具有高度保守性，這可能與其參與構(gòu)成細(xì)胞骨架等重要功能密切相關(guān)[6-7]。近年來有研究認(rèn)為，ACTB基因不適合作為內(nèi)參基因，有多種因素影響其表達(dá)，有胰島素、氫化可的松、β-雌二醇等生物刺激能夠影響其表達(dá)，不同生長階段、某種疾病都會影響ACTB基因的表達(dá)量也不同[8-10]。因此也有人采用GAPDH和18 s等作為內(nèi)參基因，但是ACTB基因仍然是最常用的內(nèi)參基因[11-12]。本研究克隆ACTB基因序列可作為中國本地豬的基因序列參照，為后續(xù)ACTB蛋白質(zhì)的表達(dá)提供理論依據(jù)，并可用于制備多克隆抗體，作為研究香豬蛋白的表達(dá)水平的參照。

[1]Ma H M,Mai K S,Liufu Z G,et al.Cloning and characterization of an actin gene of Chlamys farreri and the phylogenetic analysis of mollusk actins[J].Chinese Journal of Oceanology and Limnolo?gy,2007,25（3）:304-309.

[2]劉秀霞,梁旭方,王琳,等.鱖魚（Siniperca chuatsi）β-肌動蛋白基因cDNA全序列與5′側(cè)翼區(qū)的克隆與分析[J].海洋與湖沼,2009,40（1）:102-108.

[3]Blitvich B J,Blair C D,Kempf B J,et al.Developmental and tis?sue specific expression of an inhibitor of apoptosis protein homo?logue from Andes triser iatus mosquitoes[J].Insect Mol Biol,2002,11（5）:431-442.

[4]Wang Z L,Wu Z H,Jian J C,et al.Cloning and expression of an actin gene in the haemocytes of pearloyster(Pinctada fucata,Gould 1850)[J].Marine Genomics,2008,1（2）:63-67.

[5]Miyamoto H,Hamaguchi M,Okosh K.Analysis of genes expressed in the mantle of oyster Crassostrea gigas[J].Fish Sci,2002,68（3）:651-658.

[6]Zhong H,Jonathan W S.Direct comparison of GAPDH,β-actin,cyclophilin,and 28s rRNA as internal standards for quantifying RNA levels under hypoxia[J].Biochemical and Biophysical Re?search Communications,1999,259（3）:523－526.

[7]Ruan W J,Lai M D.Actin,a reliable marker of internal control?[J].Climica Chimica Acta,2007,385（1-2）:1-5.

[8]Selvey S,Thompson E W,Matthaei K,et al.β-actin-an unsuit?able internal control for RT-PCR[J].Molecular and Cellular Probes,2001,15（5）:307-311.

[9]Gorzelniak K,Janke J,Engeli S,et al.Validation of endogenous controls for gene expression studies in human adipocytes and pre?adipocytes[J].Horm Metab Res,2001,33（10）:625-627.

[10]Verma A S,Shapiro B H.Sex-dependent expression of seven housekeeping genes in rat liver[J].Gastroenterology and Hepatolo?gy,2006,21（10）:1 004-1 008.

[11]Festuccibuselli R A,Carvalhodias A S,Deikuveura A M,et al.Ex?pression of cyp6g1 and cyp12d in DDT resistant and susceptible strains of drosophila melanogaster[J].Insect Mol Biol,2005,14（1）:69-77.

[12]Vascotto S G,Beug S,Liversage R A,et al.Nvβ-actin and Nv GAP?DH as normalization factors for gene expressionanalys is in limb re?generates and cultured bluestem cells of the adult newt,Notopht halmusviridescens[J].IntJDevBiol,2005,49（7）:833-842.