SCN5A基因變異與左心室肌致密化不全心力衰竭相關(guān)性研究

單麗沈，于憲一，邢艷琳，市田蕗子

(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院 兒科，遼寧 沈陽(yáng) 110004;2.日本富山大學(xué)附屬醫(yī)院 兒科，日本 富山 9300194)

心室肌致密化不全(left ventricular noncompaction，LVNC)是一種尚未分類(lèi)的心肌疾?。?］，其病理特征為左心室存在大量網(wǎng)狀的肌肉柱形成的肌小梁及小梁間深深的間隙。目前認(rèn)為，LVNC是胚胎時(shí)期心室肌致密化過(guò)程障礙所致［2］。該病可以兼有擴(kuò)張性心肌病或肥厚性心肌病的臨床特征，臨床表現(xiàn)多樣，可以從無(wú)癥狀到嚴(yán)重的心功能障礙以致需心臟移植，甚至死亡。多數(shù)LVNC患者存在各種心律失常及不同程度的心力衰竭［2］。

1984年Engberding等［3］報(bào)道了首例無(wú)合并其他心臟畸形的LVNC。近年來(lái)，有研究［4-6］報(bào)道了一些與LVNC相關(guān)的基因，如DTNA、TAZ和LDB3等，證實(shí)了LVNC也是一種具有遺傳異質(zhì)性的疾病。

現(xiàn)已證實(shí)，人類(lèi)心臟鈉通道alpha亞單位SCN5A基因突變與長(zhǎng) QT 綜合征(LQTS)［7］、Brugada 綜合征［8］、不明原因的夜間猝死綜合征［9］、特發(fā)性心室顫動(dòng)［10］、先天性病態(tài)竇房結(jié)綜合征［11］、心臟傳導(dǎo)缺陷(CCD)［12］及嬰兒猝死綜合征［13］等心律失常相關(guān)。最近發(fā)現(xiàn)SCN5A變異［14-15］和編碼心肌鉀通道基因KATPchannel gene(ABCC9)［16］與擴(kuò)張性心肌病有關(guān)。鈉通道在心肌細(xì)胞興奮性中扮演重要角色。它建立除極與復(fù)極電流的精細(xì)平衡，從而決定動(dòng)作電位間期。因此，SCN5A的變異可以影響這種平衡，甚至微弱的變化可以干擾通道亞單位水平的表達(dá)。SCN5A的單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性Single nucleotide polymorphisms(SNPs)不僅是遺傳性心律失常綜合征的危險(xiǎn)因素，也是獲得性心律失常的危險(xiǎn)因素［17-20］。

本研究擬通過(guò)對(duì)62例LVNC患者的SCN5A變異分析，了解編碼離子通道基因變異對(duì)LVNC病理生理相關(guān)的心律失常及重癥病例心力衰竭影響。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

全部病例均來(lái)自亞洲，共62例，其中包括17例家族病例及45例散發(fā)病例;男30例，女32例，年齡0～69歲。在明確基因型之前，首先對(duì)先證者及其相關(guān)的家族成員進(jìn)行查體及攝胸部正側(cè)位X線片、心電圖檢查，并應(yīng)用二維及彩色多普勒心臟超聲來(lái)評(píng)價(jià)心臟結(jié)構(gòu)，左心室大小、功能(短軸縮短率、射血分?jǐn)?shù))和瓣膜反流的情況。本組病例從二維超聲心動(dòng)圖可以清晰地看到由肌小梁及深深的小梁間隙構(gòu)成的致密化不全層及其外部的致密層;彩色多普勒超聲心動(dòng)圖顯示左心室內(nèi)的小梁間隙中持續(xù)有血流入(圖1)。

圖1 二維超聲心動(dòng)圖(A)及彩色多普勒超聲心動(dòng)圖(B)Fig 1 Two-dimensional echocardiography(A)and color Doppler echocardiogrophy(B)

1.2 臨床輔助檢查及診斷依據(jù)

1.2.1 心臟超聲 (1)肥大的左心室內(nèi)至少有一側(cè)壁的心內(nèi)膜心肌密布肌小梁;(2)左心室收縮功能降低;(3)心內(nèi)膜的致密化不全層與致密層厚度之比大于2.0;(4)從彩色多普勒上可以看到肌小梁間隱窩與左室有血流相通。

1.2.2 心電圖 應(yīng)用12導(dǎo)聯(lián)同步心電圖及動(dòng)態(tài)心電圖確診［4］。

1.2.3 心力衰竭 根據(jù)Ross 1992年嬰兒心衰診斷標(biāo)準(zhǔn)以及2001年Connolly等提出的小兒慢性心衰嚴(yán)重程度評(píng)分分級(jí)的新方法［21-22］。

1.3 分子遺傳學(xué)研究

在簽署知情同意書(shū)后，采外周靜脈血，提取DNA(試劑盒Qiagen:Valencia，CA)并立即建立細(xì)胞系。

應(yīng)用PCR方法對(duì)每名先證者的SCN5A基因進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)NCBI及Celera數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因序列，運(yùn)用在線程序Primer 3設(shè)計(jì)每段編碼外顯子及其側(cè)翼內(nèi)含子序列的PCR引物，PCR的具體方法詳見(jiàn)文獻(xiàn)［6］。在實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)需要來(lái)調(diào)整PCR的引物序列及條件。將PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物與變性緩沖液一起加熱，進(jìn)行SSCP 分析［5］。

將正常對(duì)照和異常的SSCP條帶從已經(jīng)干燥的膠片上切割下來(lái)純化后，根據(jù)Applied Biosystems(ABI)Big Dye Terminator Cycle Sequencing的實(shí)驗(yàn)方案，并應(yīng)用ABI 310自動(dòng)基因序列分析儀對(duì)樣本進(jìn)行分析，得出的基因序列與公布在NCBI上的野生型基因序列進(jìn)行對(duì)比。一旦發(fā)現(xiàn)變異，將從最原始的基因組DNA開(kāi)始，重新擴(kuò)增PCR，并將產(chǎn)物直接進(jìn)行基因序列分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有資料應(yīng)用SPSS 11.5軟件分析。兩組SNP發(fā)生率比較采用χ2檢驗(yàn)。對(duì)基因變異與心律失常關(guān)系的計(jì)算應(yīng)用邏輯回歸分析(logistic regression)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 基因序列分析

本研究隊(duì)列62例LVNC的先證者，包括45例散發(fā)病例(S)和17例家族病例(F)，并對(duì)8名相關(guān)的家族成員進(jìn)行基因型-表型關(guān)系的分析。先證者性別、確診時(shí)年齡、臨床表型及其SCN5A變異情況見(jiàn)表1。

表1 LVNC先征者的臨床及基因序列分析數(shù)據(jù)Tab 1 Clinical and molecular data for probands with LVNC

續(xù) 表

在7例家族病例和12例散發(fā)病例中，我們發(fā)現(xiàn)了6種雜合子和1種純合子變異(表1、2)。其中rs6599230:G＞A、rs1805124:A ＞G(p.H558R)、rs1805125:C ＞T(p.P1090L)和rs1805126:T＞C已經(jīng)公布在NCBI SCN5A SNP數(shù)據(jù)庫(kù)，c.453C ＞T、c.1141-3C＞A這2種 SNPs已經(jīng)有報(bào)道［23-24］。本研究中，在合并完全性房室傳導(dǎo)阻滯(AVB)的散發(fā)病例 S43的 DNA中，發(fā)現(xiàn)了c.3996C＞T變異，未曾有過(guò)報(bào)道。

表2 本研究中的SCN5A變異Tab 2 SCN5A variants in our study

2.2 臨床資料分析

在34例合并有心力衰竭的先證者中，18例存在SCN5A變異(52.9%)，其中7例為家族病例，11例為散發(fā)病例;而28例無(wú)心力衰竭的先證者中只有1例有該基因的變異(3.57%)。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.36，P=0.000 2)。值得注意的是在合并有心力衰竭并且存在SCN5A變異的18例病例中，有17例同時(shí)存在多種類(lèi)型的心律失常，如:房室傳導(dǎo)阻滯(AVB，8例)、心房顫動(dòng)(AF，2例)、LQTS(2例)、預(yù)激綜合征(WPW，5例)、病態(tài)竇房結(jié)綜合征(SSS，2 例)、室性心動(dòng)過(guò)速(VT，7 例)、室性早搏(PVC，10例)、陣發(fā)性室上性心動(dòng)過(guò)速(PSVT，3 例)。見(jiàn)圖2。

換個(gè)角度來(lái)看，在本研究的全部病例中，有SCN5A變異的19例患者均合并有心律失常，并且18例合并心力衰竭(表2、3)。

表3 LVNC心力衰竭組與無(wú)心力衰竭組SCN5A變異率的分析比較Tab 3 Incidence of SCN5A variants in the cases with heart failure and in those without heart failure

圖2 家族病例6患者的臨床資料及基因分析圖Fig 2 The clinical and genetic information of case F6

3 討 論

現(xiàn)已證實(shí)，SCN5A的基因變化與心律失常的病理生理及心肌病相關(guān)，可以影響抗心律失常藥物的敏感性［7］。一些正常外顯子的SNPs也可以引起鈉通道生理功能的變化［14］。我們?cè)?LVNC患者中發(fā)現(xiàn)了DTNA、TAZ和 LDB3這3種基因變異［4-6］。50%以上的LVNC患者合并有心律失常及心力衰竭［25］，本研究結(jié)果與之相符。本研究將患者的SCN5A基因序列進(jìn)行逐一掃描，深入分析離子通道基因變異與心力衰竭的關(guān)系。在患者群中，我們鑒定出極有意義的基因變異數(shù)字(包括同義的和非同義的核苷酸置換)。而且，在合并有心力衰竭的患者中有著更高的該基因變異率(53%vs4%，P=0.000 2)。因此，這些數(shù)據(jù)支持編碼離子通道的基因可以潛在地決定LVNC患者預(yù)后的觀點(diǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)的變異中，H558R堿基置換位于細(xì)胞質(zhì)的Na+通道Ⅰ-Ⅱ干擾區(qū)域的鏈接處。以往的功能性研究證實(shí)，編碼R558的微小等位基因可以顯著地改變致病性SCN5A變異的表型，可以對(duì)其他變異所引起的鈉通道的功能變化進(jìn)行調(diào)節(jié)，起到基因內(nèi)的修復(fù)作用。H558R在不同的基因變異背景中對(duì)基因功能的影響大不相同，甚至致使“基因缺失”［26］。本研究中2例H558R變異者QT間期是正常的，但是他們均有很?chē)?yán)重的心律失常(PVC、WPW綜合征)及重度心力衰竭。在合并有AF的散發(fā)病例31、合并PVC的家族病例6(先證者)及有SSS(先證者母親)家族病例6的母親中，我們均發(fā)現(xiàn)了P1090L變異。P1090位于細(xì)胞質(zhì)的Na+通道Ⅱ-Ⅲ干擾區(qū)域的鏈接處，P1090L是一個(gè)亞洲人常見(jiàn)的多態(tài)現(xiàn)象，在Q1077缺失的情況下，P1090L可以導(dǎo)致一個(gè)激活中間點(diǎn)的顯著負(fù)面轉(zhuǎn)換［26］。

除c.3996C＞T之外，其他的變異可在正常人群中發(fā)現(xiàn)。不管這些變異是否影響到氨基酸序列，顯著數(shù)量的單核苷酸置換可以改變mRNA剪接的效能或精確度［5］。這些剪接改變可以是不完全的，可導(dǎo)致鈉通道表達(dá)的細(xì)微變化，在病理?xiàng)l件下可以導(dǎo)致心臟的復(fù)極化，因此，可以影響潛在LVNC致病性突變的臨床表型，對(duì)LVNC患者潛在的病理的基因變異起到修飾作用。據(jù)報(bào)道［18］，Rs1805126:T＞C與短 QT間期有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，Rs1805126:T＞C與LVNC患者的心律失常及心力衰竭的高風(fēng)險(xiǎn)性相關(guān)。

LVNC合并心力衰竭者SCN5A的變異率明顯高于無(wú)心衰者，提示心衰發(fā)病與該基因有密切的關(guān)系。如前所述大多數(shù)的SCN5A變異者均與多種形式的心律失常及心力衰竭相關(guān)，而且在同一個(gè)家族里，可以發(fā)現(xiàn)有多種心律失常表現(xiàn)型。例如，嚴(yán)重心力衰竭的第6號(hào)先證者(圖2)是一位LVNC合并PVC患者，其存在兩種變異，即rs1805126:T＞C和p.P1090L，這兩種變異均來(lái)源于其患有LVNC并合并SSS的母親。應(yīng)用回歸分析，患者帶有rs1805126:T＞C變異的有著明顯增高的心律失常及心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)性［OR=5.69(1.05，30.84)，P=0.044］。心律失常，如多源多形性室早、室速，可繼發(fā)室顫甚至猝死，加重心肌缺血，使心臟的血液動(dòng)力學(xué)產(chǎn)生改變，嚴(yán)重影響該病的預(yù)后。而心室擴(kuò)張和張力增高可產(chǎn)生早期后除極、有效不應(yīng)期不均一縮短及復(fù)極不均一性。在心肌的缺血及炎性反應(yīng)等因素作用下，心肌細(xì)胞間出現(xiàn)微小纖維化引起傳導(dǎo)延緩、單向阻滯及心率增快并引起心室肌電傳導(dǎo)重構(gòu)。

綜上所述，對(duì)LVNC患者及早進(jìn)行SCN5A基因分析，應(yīng)用電生理技術(shù)及時(shí)發(fā)現(xiàn)各種心律失常并予以早期控制，對(duì)提高LVNC的治療效果及預(yù)后判斷具有重要意義。

由于PCR-SSCP分析的敏感性相對(duì)低，本研究所報(bào)道的SNPs要低于實(shí)際值。此外，在血樣分析的過(guò)程中，分析者不了解患者的臨床表現(xiàn)，因此，避免了人為的差異。然而，由于技術(shù)及實(shí)驗(yàn)儀器的原因，還存在著一定的假陰性率。因此，進(jìn)一步的研究期望通過(guò)細(xì)胞內(nèi)酸中毒或誘導(dǎo)的鈣超載以獲得更多的新發(fā)現(xiàn)。

LVNC合并心律失常的患者中，SCN5A變異的發(fā)生率顯著高于沒(méi)有合并心律失常的患者，證實(shí)了SCN5A的變異可以增加LVNC患者心律失常發(fā)生的假設(shè)。此外，心律失常發(fā)生率提高也增加了心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)。由此，我們推測(cè)那些能恢復(fù)鈉通道功能的藥物可能為L(zhǎng)VNC患者提供新的治療方法。

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