肺動(dòng)脈高壓對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞與骨形成蛋白-2的影響

張韓，李彥明，劉楓，萬(wàn)琪琳，程冠昌，洪巖，陳君柱

特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓（idiopathic pulmonary arterial hypertension，IPAH）是一種以彌漫性肺小動(dòng)脈痙攣和血管重構(gòu)為特征的疾病，典型病理改變?yōu)榉尾恐睆叫∮?00μm的后小動(dòng)脈中膜增厚，內(nèi)皮細(xì)胞呈向心性單克隆性叢樣增生，早期診斷率低，預(yù)后差[1]?，F(xiàn)已證明骨形成蛋白-2（BMP-2）不僅能夠直接抑制血管平滑肌的生長(zhǎng)，還可抑制血清轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）刺激引起的血管平滑肌增殖[2]，同時(shí)還有減少肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用[3]：上述發(fā)現(xiàn)提示BMP-2可能在IPAH的發(fā)病過(guò)程中具有重要的作用；內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，已有研究證實(shí)向肺動(dòng)脈高壓小鼠模型的肺血管中移植內(nèi)皮祖細(xì)胞可以減低肺血管阻力[4,5]。本研究擬通過(guò)比較IPAH患者和正常對(duì)照人群的血漿BMP-2水平和外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量，評(píng)價(jià)IPAH對(duì)二者的影響，及BMP-2水平與肺動(dòng)脈壓力（PAP）和EPC的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2008年1月～2010年6月住院的IPAH患者28例為試驗(yàn)組，年齡（33.11±10.42）歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照世界衛(wèi)生組織2003年診斷標(biāo)準(zhǔn)，即靜息時(shí)平均肺動(dòng)脈壓大于25 mmHg（1mmHg=0.133kPa)，運(yùn)動(dòng)時(shí)平均肺動(dòng)脈壓大于30 mmHg；同期納入健康志愿者20例為對(duì)照組，年齡（32.11±10.12）歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：近期有外傷、外科手術(shù)、炎癥及有糖尿病、腎病、腫瘤、骨折病史者。

1.2 方法①右心漂浮導(dǎo)管測(cè)定肺動(dòng)脈壓力：采用頸靜脈或者穿刺方法，放置7F靜脈鞘管后，飄浮導(dǎo)管放置右心室進(jìn)入肺動(dòng)脈測(cè)定壓力；②BMP-2測(cè)定：禁食12小時(shí)以上采血，ELISA法檢測(cè)BMP-2水平，試劑盒購(gòu)自博士德生物科技公司。③EPC檢測(cè)：無(wú)菌采集空腹外周血20ml，分層后獲取單個(gè)核細(xì)胞，將其接種在人纖維連接蛋白包被培養(yǎng)板上，以梭形粘附細(xì)胞作為單個(gè)核細(xì)胞，在培養(yǎng)7 d后行Dil標(biāo)記乙?；说兔芏戎鞍祝―IL-AC-LDL）和熒光素植物血凝素-Ⅰ（FITC-UEA-Ⅰ）雙熒光染色鑒定，以雙染色陽(yáng)性細(xì)胞為正在分化的EPC，在倒置熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)3個(gè)隨機(jī)選擇視野（×200）的EPC，計(jì)算得到平均值作為EPC計(jì)數(shù)結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用雙變量相關(guān)分析，結(jié)果采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 兩組EPC計(jì)數(shù)結(jié)果（×400）

2 結(jié)果

2.1 一般資料 試驗(yàn)組和對(duì)照組的年齡、性別及血脂水平均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05，表1）。

表1 兩組對(duì)象的臨床基本資料比較

2.2 BMP-2濃度和EPC數(shù)量 試驗(yàn)組血漿BMP-2的濃度顯著高于對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，表2）；試驗(yàn)組外周血EPC數(shù)量顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，表2、圖1）。

表2 試驗(yàn)組與對(duì)照組BMP-2和EPC的比較

2.3 BMP-2與PAP及EPC水平的相關(guān)性分析 試驗(yàn)組經(jīng)右心漂浮導(dǎo)管檢測(cè)得到的平均PAP為（52.9±3.1） mmHg。將BMP-2水平分別與PAP和EPC數(shù)量進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，BMP-2與PAP為正相關(guān)（r=0.625，P＜0.01）；與EPC為負(fù)相關(guān)（r=-0.736，P＜0.01）。

3 討論

IPAH患者因肺細(xì)小動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖紊亂，平滑肌細(xì)胞增殖過(guò)度，血管叢狀增生，損傷修復(fù)不平衡，導(dǎo)致局部血管增生過(guò)多，血管阻力增加，造成肺動(dòng)脈壓力升高，最終導(dǎo)致右心衰[2]。

BMP-2屬于骨形成蛋白家族，最先在骨基質(zhì)中分離出來(lái)，并可在異位區(qū)誘導(dǎo)新生骨形成。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，家族性IPAH患者和40%特發(fā)性IPAH患者中都存在BMP受體基因突變[6]，可見(jiàn)BMPs及其受體系統(tǒng)在IPAH疾病形成過(guò)程中扮演著重要角色。同時(shí)，Tuder[7]和Voelkel 還發(fā)現(xiàn)，BMP-2誘導(dǎo)的IPAH患者肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率低于健康者，但誘導(dǎo)EPC的凋亡率卻高于健康者。本研究結(jié)果表明，IPAH患者的血漿BMP-2的水平顯著高于對(duì)照組，提示BMP-2濃度升高可能與IPAH有關(guān)。

曾有研究發(fā)現(xiàn)人外周血CD34+或VEGFR-2+細(xì)胞在體外能增殖、轉(zhuǎn)化為EPC[6]，目前鑒定EPC方法主要包括[5,8]流式方法檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志（如CD34、Flk-1、vWF和CD133等）和熒光顯微鏡雙染色鑒定。兩種方法的可信度均較高，本研究選擇了后者，所得的結(jié)果也較為明顯。Murohara[9]研究發(fā)現(xiàn)，EPC不僅參與胚胎血管形成，同時(shí)也參與出生后血管生成和內(nèi)皮損傷修復(fù)，新生血管中有25%的內(nèi)皮細(xì)胞是由EPC分化而來(lái)的。本研究結(jié)果表明，試驗(yàn)組循環(huán)血中EPC數(shù)量較對(duì)照組顯著降低，且與血漿中BMP-2濃度呈負(fù)相關(guān)，提示BMP-2可能通過(guò)抑制EPC數(shù)量，減弱EPC修復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，促進(jìn)肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生。

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