田菁莖瘤固氮根瘤菌對(duì)小麥種子侵染的促生作用及其在根系內(nèi)的定殖

劉華偉，孫 超，楊 呼，林曉軍，郭藹光*

(1西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌712100;2旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌712100)

目前，在我國(guó)過(guò)度使用化肥以及由此引發(fā)的一系列環(huán)境等問(wèn)題已引起了國(guó)內(nèi)外普遍關(guān)注［1－3］。如果主要農(nóng)作物能夠?qū)崿F(xiàn)生物固氮，減少對(duì)化肥的依賴，既節(jié)省能源，又保護(hù)環(huán)境，對(duì)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展將具有里程碑意義，對(duì)人類健康具有長(zhǎng)遠(yuǎn)的重大影響［4］。

固氮菌除自生固氮、共生固氮外，還存在第三種生活形式：與非豆科草本植物(水稻、小麥、玉米、高粱、油菜等)聯(lián)合固氮(Associative Symbiotic Nitrogen Fixation)［5］。固氮菌能定殖于根表面或近根處土壤，部分還能定殖于植物組織內(nèi)部，與宿主有密切聯(lián)系但又不與其形成特化結(jié)構(gòu)。聯(lián)合固氮，可減少非豆科草本植物氮肥使用量，有利于降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，減輕化肥污染，保護(hù)生態(tài)環(huán)境。聯(lián)合固氮菌還作為植物促生菌(Plant Growth Promoting Bacteria，PGPB)，會(huì)分泌吲哚乙酸(IAA)等激素，可促進(jìn)植物生長(zhǎng)，增加產(chǎn)量，并對(duì)植物不造成病害，為非豆科草本植物尤其是禾本科作物的生物固氮拓寬了領(lǐng)域［6］。

田菁莖瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans，A．caulinodans)ORS571，能通過(guò)裂隙侵染方式誘導(dǎo)豆科植物毛萼田菁(Sesbania rostrata)根與莖結(jié)瘤固氮。由于其對(duì)氧濃度的要求較其他根瘤菌寬松，已用于禾本科作物生物固氮的研究［7］。本研究在室內(nèi)限菌條件下利用綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記A．caulinodans侵染小麥種子，篩選對(duì)其敏感小麥品種，探索不同菌液濃度和添加葡萄糖對(duì)其浸種侵染效率的影響，利用熒光顯微鏡檢測(cè) GFP標(biāo)記A．caulinodans在小麥幼苗根中的定殖規(guī)律。田間試驗(yàn)結(jié)果表明A．caulinodans浸種侵染對(duì)不同小麥品種均具較明顯的促生作用，為深入研究A．caulinodans與小麥互作機(jī)制，更好地將其應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1．1 小麥品種與菌株 小麥品種小偃22、小偃6號(hào)、西農(nóng)979和陜253由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供;綿陽(yáng)19和鄭引1號(hào)均由西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院保存;周麥18和矮抗58為市售小麥種子。綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記A．caulinodans含pHC60質(zhì)粒，TCR由中國(guó)科學(xué)院植物研究所饋贈(zèng)。

1.1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件 TY液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨5 g/L，酵母粉 3 g/L，CaCl2·2H2O 0.88 g/L，pH 7.4)用于A．caulinodans的活化與擴(kuò)培，28℃，220 r/m培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期備用。

YMA固體培養(yǎng)基(甘露醇 10 g/L，酵母粉3 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，NaCl 0.1 g/L，CaCO33g/L，瓊脂粉 18 g/L，pH 7.0)用于從接菌小麥體內(nèi)分離A．caulinodans和計(jì)數(shù)。

1.2 方法

1.2.1 種子處理及限菌培養(yǎng) 選取飽滿、均勻一致的小麥種子，先用1%次氯酸鈉浸泡10 min，無(wú)菌水清洗3次;再用75%酒精浸泡30s，無(wú)菌水沖洗3次，進(jìn)行表面消毒。參照Senthilkumar方法將表面消毒的種子均勻置于大試管(高23cm，直徑4cm)中已滅菌的瓊脂–水固體培養(yǎng)基(瓊脂粉5g，蒸餾水1000 mL)(以下簡(jiǎn)稱培養(yǎng)基)表面，種溝朝下，胚朝向同一個(gè)方向，進(jìn)行限菌培養(yǎng)［8，11］。培養(yǎng)條件(ZPW－280B智能植物培養(yǎng)箱)：光照16 h，光強(qiáng)4級(jí)，溫度25℃，相對(duì)濕度46%;黑暗8 h，光強(qiáng)0級(jí)，溫度18℃，相對(duì)濕度37%。

1.2.2 敏感性品種篩選 室內(nèi)條件下，將8個(gè)品種的小麥種子表面消毒，置于培養(yǎng)基上限菌培養(yǎng)，每管9粒，設(shè)4次重復(fù)。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A．caulinodans于50 mL離心管中，8000 r/m離心10 min收集菌體，用PBS緩沖液(KH2PO40.24 g/L，KCl 0.2 g/L，NaCl 8 g/L，Na2HPO41.44 g/L，pH 7.4)稀釋，吸取1 mL PBS稀釋菌液(約1.0×108個(gè)/mL)加入到培養(yǎng)基表面;平行對(duì)照接1 mL PBS緩沖液。培養(yǎng)條件同上，接菌后第9 d測(cè)量不同小麥品種幼苗根長(zhǎng)與株高。

1.2.3 浸種侵染 室內(nèi)條件下，預(yù)先進(jìn)行種子處理和限菌培養(yǎng)。選取對(duì)A．caulinodans敏感品種小偃22種子，表面消毒后置于培養(yǎng)基上，每管9粒，設(shè)4次重復(fù)，在種子萌發(fā)前，吸取1 mL PBS稀釋菌液(菌數(shù)約1.0×108個(gè)/mL)加入到培養(yǎng)基表面;平行對(duì)照接1mL PBS緩沖液。培養(yǎng)條件同上，接菌后第9d測(cè)量幼苗根長(zhǎng)與株高，并統(tǒng)計(jì)萌發(fā)的根數(shù)。

1.2.4 不同菌液濃度浸種侵染 室內(nèi)條件下，預(yù)先進(jìn)行種子處理和限菌培養(yǎng)。再將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(菌數(shù)約1.0×109個(gè)/mL)的A．caulinodans離心收集菌體，用PBS緩沖液分別稀釋為1.0×109個(gè)/mL、1.0×108個(gè)/mL、1.0×107個(gè)/mL、1.0×106個(gè)/mL四個(gè)不同濃度，分別加到培養(yǎng)基表面;平行對(duì)照接1 mL PBS緩沖液。培養(yǎng)條件同上，接菌后第9 d測(cè)量不同菌液濃度浸種侵染后小偃22幼苗根長(zhǎng)與株高。

1.2.5 添加葡萄糖對(duì)浸種侵染的影響 室內(nèi)條件下，預(yù)先進(jìn)行種子處理和限菌培養(yǎng)。由于小麥種子和A．caulinodans均接種在培養(yǎng)基上，為了避免浸種侵染早期A．caulinodans與小麥幼苗競(jìng)爭(zhēng)利用小麥種子碳源而影響小麥幼苗生長(zhǎng)，設(shè)置事先將葡萄糖添加于瓊脂–水固體培養(yǎng)基中(1 L培養(yǎng)基添加1 g葡萄糖)、將1 g/L葡萄糖添加到PBS稀釋菌液(約1.0×108個(gè)/mL)中和不添加葡萄糖3種處理。吸取1 mL PBS稀釋菌液(約1.0×108個(gè)/mL)加入大試管中培養(yǎng)基上;平行對(duì)照接1 mL PBS緩沖液。培養(yǎng)條件同上，接菌后第9 d測(cè)量小偃22幼苗根長(zhǎng)與株高。

1.2.6 熒光顯微鏡檢測(cè)和平板計(jì)數(shù) 選取接菌第3 d、第5 d、第7 d、第9 d等不同時(shí)期的幼苗根進(jìn)行表面消毒，將沖洗液放置于含10 μg/mL四環(huán)素的YMA固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)，用于檢測(cè)表面消毒是否徹底。然后徒手切片，制片，用熒光顯微鏡檢測(cè)GFP標(biāo)記A．caulinodans在小麥幼苗根組織內(nèi)部的分布狀況。離心收集菌體，用PBS－甘油緩沖液(含30%甘油PBS緩沖液)稀釋為1.0×109倍、1.0×108倍、1.0×107倍、1.0×106倍，均勻涂布到含有10μg/mL四環(huán)素的YMA固體培養(yǎng)基，28℃倒置培養(yǎng)，每個(gè)梯度設(shè)4個(gè)重復(fù)，計(jì)算平板菌落的平均值。

1.2.7 田間試驗(yàn) 田間試驗(yàn)采用6個(gè)小麥品種(表1)。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A．caulinodans菌液用無(wú)菌水稀釋成 1.0×108個(gè)/mL，向其中添加KH2PO40.5 g/L，1%(NH4)2Mo2O7·4H2O 1 mL/L和吐溫20 50 mL/L，采用淀粉與無(wú)菌水稀釋菌液混合后均勻拌種。同等條件下以無(wú)菌水替代A．caulinodans與淀粉混合后均勻拌種，作為平行對(duì)照，室溫下陰干備用。

試驗(yàn)于2010～2011年度在西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗(yàn)田中進(jìn)行。前茬為夏閑地，地勢(shì)平坦，肥力中等，土壤中有機(jī)質(zhì)含量 14.5 g/kg，速效氮 38.7 mg/kg，速效磷 11.2 mg/kg，速效鉀 120.0 mg/kg，灌溉方便。每個(gè)小麥參試品種設(shè)置4個(gè)處理和4個(gè)對(duì)照，采用隨機(jī)區(qū)組排列，行距15 cm，小區(qū)面積10 m2(2 m×5 m)，劃分保護(hù)行。其他田間管理同高產(chǎn)大田。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 Excel和 SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥8個(gè)品種對(duì)A．caulinodans的敏感性差異

室內(nèi)限菌條件下，A．caulinodans對(duì)8個(gè)品種小麥幼苗均具有促生作用，但不同品種對(duì)A．caulinodans的敏感程度不同。接菌后第9d測(cè)量處理與對(duì)照小麥幼苗根長(zhǎng)和株高(圖1)，對(duì)根長(zhǎng)經(jīng)過(guò)正態(tài)性檢驗(yàn)，其數(shù)據(jù)符合正態(tài)性分布，通過(guò)最小顯著差異法(LSD)檢驗(yàn)，得出綿陽(yáng)19、小偃6、西農(nóng)979和小偃22 的 P 值分別為 0.030、0.002、0.007 和 0.008，在0.05水平上差異顯著。對(duì)株高經(jīng)過(guò)正態(tài)性檢驗(yàn)，其數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，通過(guò)最小顯著差異法(LSD)檢驗(yàn)，得出小偃22和綿陽(yáng)19的P值分別為0.032和0.007，在0.05水平上差異顯著。綜合以上分析，以小偃22差異最顯著，接菌后幼苗平均根長(zhǎng)較對(duì)照增加了14.94%，平均株高較對(duì)照增加了9.38%，可作為首選試驗(yàn)品種用于深入研究A．caulinodans與小麥相互作用的分子機(jī)制。

圖1 A．caulinodans浸種侵染8個(gè)小麥品種后第9d小麥幼苗根長(zhǎng)與株高Fig．1 Seeding root lengths and shoot heights of eight wheat cultivars after 9 days of infection with A．caulinodans

2．2 浸種侵染 A．caulinodans對(duì)小麥幼苗生長(zhǎng)的影響

室內(nèi)限菌條件下，用PBS稀釋A．caulinodans菌液(約1．0×108個(gè)/mL)浸種侵染小偃22，接菌后第9 d統(tǒng)計(jì)小偃22幼苗根長(zhǎng)、萌發(fā)根數(shù)和株高結(jié)果顯

2.3 不同菌液濃度浸種侵染對(duì)小麥幼苗生長(zhǎng)的影響

用PBS緩沖液將擴(kuò)培至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A．caulinodans(約 1.0×109/mL)分別稀釋為1.0×109個(gè)/mL(A)、1.0×108個(gè)/mL(B)、1.0×107個(gè)/mL(C)、1.0×106個(gè)/mL(D)。室內(nèi)限菌條件下，用4個(gè)不同濃度菌液浸種侵染小偃22，接菌后第9 d測(cè)量結(jié)果顯示，A、B、C和D幼苗平均根長(zhǎng)較對(duì)照分別增加了 7.82%、20.11%、17.14%和14.87%，B、C和 D平均株高較對(duì)照分別增加了22.48%、12.51%、11.93%，但是在A濃度下平均株高較對(duì)照降低了3.27%(圖4)，表明過(guò)高的菌濃度浸種侵染對(duì)小麥幼苗生長(zhǎng)具抑制作用，菌液濃度菌示，浸種侵染后小麥幼苗萌發(fā)5和6個(gè)根的比例明顯增加，萌發(fā)3和4個(gè)根的比例下降(圖2)。平均根長(zhǎng)較對(duì)照增加了17．04%，平均株高較對(duì)照增加了8．37%(圖 3)，表明A．caulinodans浸種侵染對(duì)小麥種子生根萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)具明顯促生作用。數(shù)為1.0×108個(gè)/mL最適于浸種侵染。

2.4 添加葡萄糖對(duì)A．caulinodans浸種侵染小麥幼苗生長(zhǎng)的影響

在瓊脂–水固體培養(yǎng)基中添加濃度為1 g/L的葡萄糖，對(duì)小麥幼苗根的伸長(zhǎng)具明顯抑制作用;未添加葡萄糖浸種侵染后的幼苗平均根長(zhǎng)較對(duì)照僅增加了5.84%，平均株高較對(duì)照增加了18.65%。但是在A．caulinodans菌液中添加1 g/L葡萄糖，浸種侵染后幼苗平均根長(zhǎng)較對(duì)照增加了8.65%，平均株高較對(duì)照增加了23.24%，促生效果更加明顯(圖5)。表明添加葡萄糖對(duì)A．caulinodans浸種侵染小麥后的促生效果具有輔助作用。

2.5 熒光顯微鏡檢測(cè)GFP標(biāo)記A．caulinodans在小麥幼苗根中的定殖

利用熒光顯微鏡檢測(cè)浸種侵染小麥幼苗根中的GFP標(biāo)記A．caulinodans。結(jié)果顯示，與對(duì)照(圖6A)相比，A．caulinodans可通過(guò)根毛和側(cè)根裂隙(圖6 C)進(jìn)入根部組織，在根維管組織和細(xì)胞間隙定殖(圖6B)。對(duì)檢測(cè)到GFP標(biāo)記A．caulinodans組織進(jìn)行表面消毒，研磨后進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，根部A．caulinodans為2.4 ×107，再次表明A．caulinodans可在小麥根組織內(nèi)部定殖。

2.6 田間試驗(yàn)與統(tǒng)計(jì)

圖6 GFP標(biāo)記A．caulinodans在小偃22幼苗根內(nèi)定殖熒光顯微鏡圖Fig．6 Colonization of GFP －labeled A．caulinodans in roots of wheat seedling by fluorescence microscope

在同等栽培條件下，A．caulinodans浸種侵染除周麥18與對(duì)照間產(chǎn)量差異不大外，其他5個(gè)參試品種A．caulinodans浸種侵染較對(duì)照實(shí)際產(chǎn)量均有增加，小偃22增產(chǎn)1273 kg/hm2，小偃6號(hào)增產(chǎn)979 kg/hm2，西農(nóng) 979增產(chǎn) 772 kg/hm2，矮抗 58增產(chǎn)535 kg/hm2，綿陽(yáng)19增產(chǎn)265 kg/hm2。小偃22和小偃6號(hào)A．caulinodans浸種侵染與對(duì)照相比成穗數(shù)、穗粒數(shù)和千粒重差異顯著，進(jìn)行SPSS單因素方差分析結(jié)果，經(jīng)F檢驗(yàn)在0.05水平上差異顯著。其中小偃22各項(xiàng)指標(biāo)增長(zhǎng)最為明顯，千粒重較對(duì)照增加了3.5 g，產(chǎn)量較對(duì)照增加了23.82%(表1)。

表1 小麥產(chǎn)量及構(gòu)成要素Table 1 Wheat yield and yield components

3 討論

3.1 A．caulinodans浸種侵染小麥體系的優(yōu)化

植物與細(xì)菌的相互作用具有種屬專一性，某些細(xì)菌的基因型與一定基因型的植物品種間存在最佳配合［9－10］。結(jié)合農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)際，高效浸種侵染體系的建立與聯(lián)合固氮菌在非寄主植物中定殖與遷移能力密切相關(guān)，較高的細(xì)菌群體密度可彌補(bǔ)聯(lián)合固氮菌在非寄主植物中有限的定殖能力。

本研究室內(nèi)限菌試驗(yàn)與田間試驗(yàn)結(jié)果一致表明小偃22為對(duì)A．caulinodans敏感的小麥品種;通過(guò)優(yōu)化菌液濃度、添加外源葡萄糖等措施，優(yōu)化了室內(nèi)限菌條件下A．caulinodans浸種侵染小麥的體系;結(jié)合大田實(shí)際，在A．caulinodans菌液中添加鉬元素以增強(qiáng)A．caulinodans固氮酶的活性，添加吐溫20、淀粉等措施使菌液與小麥種子充分混合均勻，室溫陰干，建立了大田條件下A．caulinodans侵染小麥體系，對(duì)于進(jìn)一步深入研究A．caulinodans與小麥相互作用的分子機(jī)制，更好地將其應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)際具有重要意義。

3.2 A．caulinodans在小麥幼苗根系內(nèi)的定殖

聯(lián)合固氮菌可從傷口和自然開(kāi)口(側(cè)根裂隙、氣孔、莖皮孔)侵染非豆科植物，定殖于根的表皮、皮層和維管系統(tǒng)的細(xì)胞間隙和細(xì)胞內(nèi)，形成生態(tài)小境［11］。遲峰等研究表明定殖于植物根內(nèi)的固氮菌可向上遷移，在水稻中可到達(dá)葉鞘和葉［12－13］，在煙草中可到達(dá)莖、葉、甚至在生殖器官子房中也有固氮菌定殖［11］。劉元等研究了巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilenseYu62)在玉米根中的定殖規(guī)律［14］。劉華偉等研究了巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilenseYu62)在小麥體內(nèi)的定殖規(guī)律及其促生作用［15］。

本研究利用熒光顯微鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，小麥幼苗根與根圍環(huán)境在A．caulinodans浸種侵染過(guò)程中扮演著重要角色。A．caulinodans可通過(guò)根毛和側(cè)根裂隙侵入小麥根部，進(jìn)入根維管束組織，并在維管束組織和細(xì)胞間隙中定殖，本研究結(jié)果與遲峰等、劉元等研究固氮菌在水稻、煙草、玉米等非豆科作物中的分布定殖規(guī)律一致［11，13－14］。

3.3 A．caulinodans對(duì)小麥的促生作用

非豆科植物與聯(lián)合固氮菌相互作用揭示了一個(gè)另一形式的固氮系統(tǒng)，聯(lián)合固氮菌還可作為植物促生菌促進(jìn)植物生長(zhǎng)，增加產(chǎn)量，并不會(huì)對(duì)植物造成病害或傷害，從而為非豆科植物尤其是禾本科作物生物固氮提供了一個(gè)更廣闊的研究領(lǐng)域。

遲峰等用A．caulinodans等根瘤菌侵染水稻、煙草種子，利用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)到GFP標(biāo)記根瘤菌作為聯(lián)合固氮菌分布植物全身，并提高植物光合作用效率，促進(jìn)植物生長(zhǎng)。應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究表明接種固氮菌促進(jìn)了水稻防御、光合、代謝等相關(guān)蛋白的表達(dá)，與光合作用和能量等相關(guān)一些蛋白表達(dá)顯著上調(diào)［11，16］。Senthilkumar等在遲峰工作基礎(chǔ)上，利用A．caulinodans接種水稻，熒光顯微鏡檢測(cè)結(jié)果表明GFP標(biāo)記A．caulinodans遍布水稻各組織。接種A．caulinodans可顯著提高水稻蛋白質(zhì)含量、總氮量和固氮酶活力，生物質(zhì)總量相比對(duì)照提高5.4% ～16%［8］。

聶延富、陳廷偉等利用低濃度的2，4－D誘發(fā)小麥根部產(chǎn)生瘤狀結(jié)構(gòu)(類根瘤)，A．caulinodans可侵染并在類根瘤內(nèi)的細(xì)胞間隙和細(xì)胞內(nèi)大量增殖，并向結(jié)瘤小麥提供 16% ～ 23% 的氮素［17，7］。對(duì)A．caulinodans離體發(fā)酵培養(yǎng)驗(yàn)證其能產(chǎn)生吲哚乙酸(IAA)及赤霉素(GA)類物質(zhì)［18］。潘佩平等初步研究了接種A．caulinodans泌銨型突變株對(duì)盆栽小麥生長(zhǎng)的影響［19］。

田間試驗(yàn)研究結(jié)果顯示A．caulinodans浸種侵染使小偃22穗數(shù)和穗粒數(shù)較對(duì)照增多4.54%和9.80%、千粒重較對(duì)照增加8.01%、產(chǎn)量較對(duì)照提高1273 kg/hm2，平均增產(chǎn)23.82%，表明A．caulinodans浸種侵染對(duì)小偃22具有較明顯的促生作用。但A．caulinodans在小麥體內(nèi)定殖是否具有固氮作用?如何提高A．caulinodans聯(lián)合固氮的效率有待于進(jìn)一步深入研究。

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