急性肝衰竭大鼠血清與組織中降鈣素原的檢測及意義

徐 虹 李 汛 王魯文 龔作炯

武漢大學(xué)人民醫(yī)院感染科 (湖北武漢，430060)

急性肝功能衰竭是一種病因復(fù)雜、進(jìn)展快、病情重、病死率高的臨床綜合征，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，尚未闡明。但目前大多數(shù)學(xué)者支持由病毒直接或間接 (免疫反應(yīng))所致的原發(fā)性損害;由內(nèi)毒素及多種細(xì)胞因子如TNF-α、IL-4等介導(dǎo)的繼發(fā)性損傷的“兩次打擊”學(xué)說［1］。降鈣素原 (Procalcitonin，PCT)是無激素活性的前肽物質(zhì)，是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種具有高特異性和敏感性的炎癥感染指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)通過建立D-氨基半乳糖鹽酸鹽誘導(dǎo)的大鼠急性肝衰竭 (acute liver failure，ALF)模型，觀察大鼠ALF時(shí)血清及組織中PCT水平的變化，探討PCT與細(xì)胞因子變化之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動物模型的制備 將25只雄性Wistar大鼠 (武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物實(shí)驗(yàn)中心，重200～220g)隨機(jī)分為兩組：①模型組20只，大鼠在禁食后12小時(shí)腹腔注射D-氨基半乳糖鹽酸鹽溶液 (江蘇省啟東市經(jīng)貿(mào)有限公司)，每只大鼠注射的劑量為1.2g/kg;②正常組5只，于大鼠腹腔內(nèi)注射等量生理鹽水，24小時(shí)后處死。模型組大鼠在造模后12小時(shí)及24小時(shí)，分別取10只大鼠用10%水合氯醛麻醉，行心臟采血，分離血清，-80℃凍存?zhèn)錂z。同時(shí)留取肝組織、脾組織、小腸組織各100mg，加入0.9%生理鹽水350μl，冰上勻漿，4℃離心后取上清液，-80℃凍存?zhèn)錂z。另取部分肝組織用10%甲醛溶液固定，行常規(guī)的石蠟包埋，切片，HE染色，觀察肝組織的病理學(xué)改變。

1.2 檢測指標(biāo)與方法 ①血清及組織PCT的檢測：采用ELISA法檢測大鼠血清及肝臟、脾臟、小腸組織的PCT，實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒 (上海西唐生物科技有限公司)說明書操作。②血清細(xì)胞因子水平的檢測：采用ELISA法檢測大鼠血清TNF-α、IFN-γ及IL-4，實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒 (美國eBioscience公司)說明書操作。③內(nèi)毒素的檢測：鱟試劑檢測，實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用(±s)表示，采用兩個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，相關(guān)性分析采用pearson檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)變化 高倍鏡下顯示：正常組大鼠肝組織的肝小葉結(jié)構(gòu)完整、清晰，肝細(xì)胞無變性壞死，炎癥活動度分級及纖維化程度分期分別為G0、S0，HAI積分0。模型組大鼠12小時(shí)肝細(xì)胞片狀壞死，肝索紊亂，炎癥細(xì)胞浸潤，肝組織炎癥活動度為G3;24小時(shí)時(shí)肝細(xì)胞大塊壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)失常，大量炎癥細(xì)胞浸潤，肝組織炎癥活動度為G4。見插見圖1。

2.2 兩組大鼠血清PCT、TNF-α、IFN-γ、IL-4及內(nèi)毒素水平變化 見表1。

正常組大鼠血清PCT的水平很低，PCT及TNF-α、IFN-γ、IL-4、內(nèi)毒素在模型組12小時(shí)時(shí)已有升高，24小時(shí)時(shí)仍持續(xù)在較高水平，各組間比較差異有顯著性意義 (P＜0.05)。

2.3 兩組大鼠組織PCT水平變化 見表2。由表2可知，正常組大鼠的肝臟、脾臟、小腸組織中也可檢測到PCT，但是在模型組12小時(shí)時(shí)迅速升高，24小時(shí)還持續(xù)在較高水平，各組間差異有顯著性意義 (P＜0.05)。

2.4 相關(guān)性分析 模型組大鼠血清PCT(12小時(shí)或24小時(shí))與TNF-α、IFN-γ、IL-4、內(nèi)毒素 (12小時(shí)或24小時(shí))成顯著正相關(guān) (P ＜ 0.05)，r值分別為 0.743，0.723，0.730，0.725，0.789，0.788，0.789，0.769。

表1 大鼠血清PCT與TNF-α、IFN-γ、IL-4及內(nèi)毒素水平比較(±s)

表1 大鼠血清PCT與TNF-α、IFN-γ、IL-4及內(nèi)毒素水平比較(±s)

與正常組比較，*P＜0.05

組別PCT(ng/ml)TNF-α(pg/ml)IFN-γ(pg/ml)IL-4(pg/ml)內(nèi)毒素(EU/L)正常組0.025 ±0.008 1.068 ±0.956 12.53 ±0.885 0.096 ±0.401 0.291 ±0.019 ALF組12h 1.114 ±0.053*29.35 ±5.103*26.20 ±0.549*1.333 ±0.142*0.599 ±0.076*24h 3.134 ±0.093*28.45 ±5.17*34.29 ±0.348*1.087 ±0.266*0.849 ±0.008*

表2 兩組大鼠組織PCT水平的比較 (ng/ml)

3 討論

PCT是近年被發(fā)現(xiàn)的一種無活性的降鈣素的前肽物質(zhì)，由116個(gè)氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為13000，血中半衰期約為22～35小時(shí)，正常時(shí)由甲狀腺的C細(xì)胞分泌。正常人體血中PCT水平很低［2］，組織中也存在PCT，以肝、胰、腎等含量相對較高。病理狀態(tài)下肝、脾、胰、肺、腎、小腸等組織也能產(chǎn)生較高的PCT［3］。有文獻(xiàn)報(bào)道，PCT是一種炎癥性介質(zhì)，可作為判斷早期炎性反應(yīng)的指標(biāo)［4］。在全身炎癥反應(yīng)綜合征、多器官功能障礙、敗血癥等嚴(yán)重感染時(shí)PCT相對于傳統(tǒng)的感染標(biāo)志物有著持續(xù)時(shí)間長，特異性高的優(yōu)點(diǎn)，可以更好地預(yù)測病情的嚴(yán)重程度，病程的時(shí)間［5］。內(nèi)毒素在革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的外層，其主要成分為脂多糖，正常時(shí)腸道內(nèi)的內(nèi)毒素被肝臟的枯否氏細(xì)胞解毒和清除。但在肝功能損害時(shí)，肝臟的枯否氏細(xì)胞的吞噬清除能力下降，內(nèi)毒素經(jīng)側(cè)支循環(huán)進(jìn)入體循環(huán)，而形成腸源性內(nèi)毒素血癥。臨床上，腸源性內(nèi)毒素血癥越來越受到重視。肝硬化患者由于腸道微循環(huán)的改變，腸黏膜充血、腫脹，屏障功能降低致使腸黏膜通透性增加，腸道細(xì)菌增多向腹腔中移位，并發(fā)腹腔感染。肝功能損害時(shí)，內(nèi)毒素作用肝臟后，引起多種細(xì)胞因子炎癥介質(zhì)的釋放，如TNF-α，導(dǎo)致免疫損害，可加重肝功能的損害，易合并細(xì)菌感染?？梢妰?nèi)毒素血癥與肝損害兩者互為因果，關(guān)系密切，隨著內(nèi)毒素水平的增加，肝損害的程度亦逐步加重［6］。Dandona等在健康人體內(nèi)注射入小劑量內(nèi)毒素后，于1、2、4、6、8、24小時(shí)檢測血漿 PCT水平，在兩小時(shí)后可檢測到少量PCT，4～6小時(shí)迅速升高，8～24小時(shí)達(dá)到高峰，2到3天后逐漸恢復(fù)到正常水平［7］。在急性胰腺炎時(shí)，血清PCT的水平可較早地評估病情的程度。急性壞死性胰腺炎時(shí)，血內(nèi)毒素的水平則可提示腸源性感染［8］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，內(nèi)毒素及細(xì)胞因子 TNF-α、IL-6等可能刺激和誘導(dǎo)了PCT的產(chǎn)生［9］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在急性肝衰竭并發(fā)感染時(shí)監(jiān)測PCT的水平可以較早地診斷和評估病情。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還提示，PCT在急性肝衰竭的發(fā)病中起著重要的作用。在正常組大鼠的肝臟、脾臟、小腸組織中可檢測到PCT，模型組大鼠的肝臟和小腸的PCT含量明顯升高。這可能與肝損害時(shí)機(jī)體器官功能的改變存在著一定的關(guān)系。在肝組織的病理形態(tài)學(xué)上，正常組大鼠肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞無變性壞死;在模型組大鼠12小時(shí)，肝細(xì)胞片狀變性、壞死，炎性細(xì)胞浸潤，模型組大鼠24小時(shí)，肝細(xì)胞大片壞死，小葉結(jié)構(gòu)失常，符合臨床上急性肝衰竭患者的病情進(jìn)展，這也與PCT水平升高的變化程度一致。

由以上結(jié)果可看出，PCT在急性肝衰竭的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。急性肝衰竭時(shí)，血清和組織中，如肝臟、小腸PCT均升高，可能與肝臟、腸道功能的改變有著一定的關(guān)系。PCT的升高對急性肝衰竭時(shí)，重癥感染及膿毒血癥的臨床診斷，抗生素的選擇應(yīng)用可提供參考作用。

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