黃芪湯對(duì)肝硬化大鼠肝臟卵圓細(xì)胞肝向分化的作用*

朱 英 劉 平

1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 (遼寧 大連，116011) 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)

目前纖維化或早期硬化組織器官的結(jié)構(gòu)重構(gòu)成為現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)中的重大科學(xué)問(wèn)題，而干細(xì)胞已成為組織器官結(jié)構(gòu)重構(gòu)過(guò)程中的研究焦點(diǎn)。干細(xì)胞是一類(lèi)具有自我更新和多向分化增殖潛能的原始細(xì)胞，其對(duì)細(xì)胞的生理性更新、對(duì)病理性損傷的反應(yīng)與修復(fù)以及組織重構(gòu)都具有重要意義。

研究顯示肝損傷過(guò)程中，干細(xì)胞參與了肝細(xì)胞再生和肝損傷修復(fù)，骨髓、胚胎等多種來(lái)源的干細(xì)胞也具有向肝細(xì)胞分化的潛能，因此從干細(xì)胞的角度探討肝細(xì)胞再生機(jī)制及再生肝臟功能具有可行性和重要性。

本研究應(yīng)用二甲基亞硝胺 (DMN)造成類(lèi)似于人類(lèi)的大鼠肝硬化模型，應(yīng)用較為敏感的Thy-1.1作為肝臟卵圓細(xì)胞(HOC)標(biāo)記物，觀(guān)察HOC在肝硬化形成與消減過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化;同時(shí)應(yīng)用雙重?zé)晒饷庖呒す夤簿劢箼z測(cè)技術(shù)觀(guān)察HOC的分化取趨向，應(yīng)用黃芪湯治療，觀(guān)察黃芪湯在肝硬化逆轉(zhuǎn)中的作用及其對(duì)HOC的影響，探討中藥在肝硬化組織重構(gòu)過(guò)程中的作用與意義。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑 wistar大鼠，雄性，體重160g±15g，清潔級(jí)，由中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心清潔區(qū)動(dòng)物房飼養(yǎng)、造模和觀(guān)察，自由飲食。DMN為東京化成工業(yè)株式會(huì)社產(chǎn)品：lot.MAL05。鼠抗Thy1.1單克隆抗體為SeroTec公司產(chǎn)品;鼠抗CK19和AFP單克隆抗體為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;激光共聚焦檢測(cè)用cy3標(biāo)記 (紅色)羊抗單克隆抗體及FITC標(biāo)記 (綠色)驢抗單克隆抗體均為Jackson Immuno Research公司產(chǎn)品。

1.2 藥物與儀器 黃芪湯(《和劑局方》，由黃芪、炙甘草、大棗組成)、由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥制劑中心進(jìn)行水煎濃縮取汁，制成流浸膏，冷凍干燥，閉光保存。激光共聚焦顯微鏡，為日本OLYMPUS公司產(chǎn)品，共聚焦型號(hào)為 FV1000SIMS Scanner，所用譜線(xiàn)為 488nm、543nm兩種激光譜線(xiàn)，物鏡為 PLSAPO60X(數(shù)值孔徑為1.4)，顯微鏡型號(hào)為IX81。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模型制備 87只雄性，wistar大鼠，重量為160g±15g。除正常組25只外，其余62只均參照J(rèn)enkins等人的方法制備DMN肝硬化模型。按DMN 10mg·kg-1劑量 (用生理鹽水稀釋)處理動(dòng)物，腹腔注射，每周連續(xù)3天，1次/d，共4周。正常組大鼠腹腔注射同等量生理鹽水。分別于造模后3天、2周、4周、6周、8周時(shí)均隨機(jī)處死造模大鼠6只，正常組大鼠3只，進(jìn)行肝臟動(dòng)態(tài)觀(guān)察。

1.3.2 分組與給藥 4周造模完成后，將50只造模大鼠隨機(jī)分為模型組25只，黃芪湯組25只。黃芪湯組大鼠于第5周第1天起，按60kg成人體重日劑量的公斤體重劑量10倍量灌胃 (10ml·kg-1體重的劑量)，1次/d，共兩周;正常組(10只)及模型組大鼠以同體積生理鹽水給予灌胃。

1.3.3 觀(guān)察指標(biāo) 觀(guān)察大鼠血清肝功能羥脯氨酸 (Hyp)含量變化，觀(guān)察肝組織HE染色、膠原纖維染色結(jié)果并進(jìn)行肝組織HOC透射電鏡檢測(cè)。肝組織α-SMA(α-平滑肌肌動(dòng)蛋白)Thy1.1免疫組化觀(guān)測(cè)，用 Envision法;肝組織 α-SMA、Thy1.1蛋白定量分析用免疫印跡法;肝組織AFP、CK19與Thy1.1共定位，采用雙重?zé)晒饷庖吖簿劢辜す鈷呙栾@微鏡技術(shù)檢測(cè) (Double Immuno Confocal Laser Scan Microscopy，DICLSM)。取冰凍肝組織切片，丙酮固定10分鐘，Blocking Buffer室溫封閉1小時(shí)，加鼠抗Thy1.1抗體4℃過(guò)夜，加cy3標(biāo)記羊抗鼠二抗室溫避光2小時(shí)，4%PFA固定20分鐘，加抗鼠AFP、CK19抗體室溫2小時(shí)，加FITC標(biāo)記驢抗鼠二抗室溫避光2小時(shí)，moviol封片，于激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量資料用計(jì)算機(jī)統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 10.0中的ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析，并用LSD程序進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 3 組大鼠肝功能檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表1。

表13 組大鼠肝功能檢測(cè)結(jié)果比較(±s)

表13 組大鼠肝功能檢測(cè)結(jié)果比較(±s)

與正常組比較，＊＊P＜0.01，與模型組比較，△P＜0.05

組別 n ALT(U/L) AST(U/L)TBil(mg/dl) Alb(g/L)正常組 5 32.86 ±8.70 64.52 ±9.42 0.25 ±0.05 27.39 ±1.46模型組 16 61.89±19.99 115.57 ±26.67＊＊0.54 ±0.33＊＊22.43 ±4.83＊＊黃芪湯組 12 62.02±11.76 97.61 ±6.53△0.33 ±0.08 △25.71 ±3.07△

2.2 3 組大鼠肝組織羥脯氨酸 (Hyp)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

表23 組大鼠肝組織Hyp檢測(cè)結(jié)果比較(±s)

表23 組大鼠肝組織Hyp檢測(cè)結(jié)果比較(±s)

與正常組比較，＊＊P＜0.01，與模型組比較，△P＜0.05

組別 n Hyp(ug/g Liver)正常組6153.24 ±17.40模型組 16 288.55 ±41.58＊＊黃芪湯組 12 252.22 ±30.93△

2.3 3 組大鼠肝組織HE染色結(jié)果 見(jiàn)插頁(yè)圖1。

2.4 3 組大鼠肝組織天狼星紅染色結(jié)果 見(jiàn)插頁(yè)圖2。

2.5 3 組大鼠肝組織α-SMA蛋白表達(dá) 結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)6周時(shí)模型組大鼠肝組織α-SMA表達(dá)明顯多于正常組，主要表達(dá)于星狀細(xì)胞，位于匯管區(qū)、纖維間隔及肝竇部位。與模型組大鼠比較，黃芪湯組大鼠α-SMA表達(dá)減少。α-SMA蛋白免疫印跡分析結(jié)果顯示，6周模型組大鼠α-SMA蛋白表達(dá)量顯著高于正常組。與模型組比較，黃芪湯組表達(dá)量顯著減少。

2.6 3 組大鼠肝組織AFP，CK19與Thy1.1共定位 見(jiàn)表3。

表3 3組大鼠肝組織AFP，CK19與Thy1.1共定位 (±s)

表3 3組大鼠肝組織AFP，CK19與Thy1.1共定位 (±s)

與模型組比較，＊＊P＜0.01

組別 n AFP(%) CK19 and Thy1.1(%)正常組300模型組 3 3.18 ±0.08 2.83 ±0.06黃芪湯組 3 1.08±0.03＊＊ 10.98±0.04＊＊

2.7 AFP與Thy1.1共定位的變化 正常組大鼠肝組織中未見(jiàn)到AFP與Thy1.1共定位陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，6周時(shí)模型組大鼠肝組織有較多表達(dá);與模型組比較，黃芪湯組大鼠肝組織AFP與Thy1.1共定位陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)量顯著降低 (P＜0.01)，(見(jiàn)插頁(yè)圖3)。

2.8 CK19與Thy1.1共定位的變化 正常組大鼠肝組織中未見(jiàn)到CK19與Thy1.1共定位陽(yáng)性細(xì)胞，6周時(shí)模型組大鼠肝組織有顯著表達(dá);與模型組比較，黃芪湯組大鼠肝組織中CK19與Thy1.1共定位陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)量顯著增加 (P＜0.01)，(見(jiàn)插頁(yè)圖4)。

3 討論

近年來(lái)，隨著干細(xì)胞研究的不斷深入，越來(lái)越多的研究表明，干細(xì)胞移植治療肝病具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。大量體內(nèi)外研究表明干細(xì)胞可以促進(jìn)損傷肝臟的修復(fù)、改善患者癥狀、提高患者存活率［1，2］。干細(xì)胞是一類(lèi)具有自我更新和多向分化潛能的原始細(xì)胞，根據(jù)其生存階段分為胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells)和成體干細(xì)胞 (adult stem cells)，胚胎干細(xì)胞因倫理問(wèn)題應(yīng)用受到限制，而成體干細(xì)胞包括造血干細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、肝干細(xì)胞等有很好的應(yīng)用前景。骨髓干細(xì)胞主要從自體和異體骨髓中獲得，無(wú)論是在生理?xiàng)l件還是病理情況下，骨髓干細(xì)胞均可以分化為成熟肝細(xì)胞［3］，而且在肝臟受損傷時(shí)，骨髓干細(xì)胞更容易定植于肝臟［4］，目前研究較多的是自體骨髓干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (Bone mesenchymal stem cells，BMSCs)［5，6］，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在干細(xì)胞標(biāo)記、分離、培養(yǎng)及移植等方面做了大量的研究工作。干細(xì)胞移植能夠幫助患者度過(guò)危險(xiǎn)期、等待損傷肝臟的再生，在終末期肝病治療中具有明顯的優(yōu)勢(shì)。

DMN大鼠肝硬化形成過(guò)程中存在肝臟卵圓細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化，即細(xì)胞的數(shù)量隨著肝纖維化程度的不斷加重而增加;在停止DMN造模兩周后，即于肝纖維化開(kāi)始消減時(shí)，該細(xì)胞數(shù)量的增加更為顯著，隨著肝纖維化的消減、停止DMN造模4周后，其數(shù)量有所減少。表明肝臟卵圓細(xì)胞的此種動(dòng)態(tài)變化與大鼠肝硬化的形成與消減的病理變化有關(guān)，尤其對(duì)肝纖維化的消減具有重要病理生理意義［7～11］。

黃芪湯能顯著降低肝硬化大鼠血清AST、TBil和肝組織Hyp含量;可明顯改善肝組織炎癥和纖維化程度，減少肝組織α-SMA的表達(dá)。在DMN大鼠肝纖維化逆轉(zhuǎn)過(guò)程中，黃芪湯可使Thy1.1標(biāo)記的HOC的數(shù)量顯著增加，同時(shí)使Thy1.1與CK19共定位細(xì)胞數(shù)量顯著增加，使HOC表型和功能發(fā)生改變，促使其向生理性成熟細(xì)胞 (尤其是膽管細(xì)胞)定向分化，從而促進(jìn)損傷肝臟組織的重構(gòu)而恢復(fù)肝臟功能。

益氣的黃芪湯可促進(jìn)已經(jīng)成型的DMN大鼠肝硬化的逆轉(zhuǎn)，其主要作用機(jī)制可能與其直接促進(jìn)HOC的表達(dá)數(shù)量有關(guān)，誘導(dǎo)HOC向膽管上皮細(xì)胞分化，同時(shí)對(duì)HOC向肝細(xì)胞的分化有一定的抑制作用。進(jìn)一步深入研究該方劑誘導(dǎo)HOC分化的作用機(jī)制不僅有重要的應(yīng)用價(jià)值，對(duì)中醫(yī)藥基礎(chǔ)研究也將有重要的理論意義。

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