版納微型豬近交系VEGF基因克隆及其組織中轉(zhuǎn)錄水平的檢測

趙 躍，王 銳，霍金龍，劉麗仙，霍海龍，楊成海，曾養(yǎng)志2,

（1.云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系，云南昆明 650031；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南省版納微型豬近交系重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201）

版納微型豬近交系（Banna Mini-pig inbred line，BM I）是云南農(nóng)業(yè)大學(xué)曾養(yǎng)志教授通過引入云南省西雙版納州拉祜族寨子中已有相當(dāng)近交程度的母豬及其仔豬，采用全同胞或親子交配兩種高度近交方法，嚴(yán)格選擇、精心培育的大型哺乳類動(dòng)物近交系。具有遺傳背景清楚、基因純合度和一致性高等優(yōu)點(diǎn)，它將為生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)、轉(zhuǎn)基因及基因修飾動(dòng)物研究、異種器官移植等領(lǐng)域的研究工作提供純系實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[1-4]。血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）是生長因子家族中最強(qiáng)的促血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原，是血管生成必不可少的重要參與因子，能夠特異性刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)血管生成，增強(qiáng)血管的滲透性[5]，與多種腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)[6]，并與腫瘤生物行為相關(guān)[7-8]。本研究以版納微型豬近交系為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，采用RT-PCR方法克隆VEGF基因，同時(shí)對(duì)18種組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平檢測，為下一步以版納微型豬近交系為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究人類VEGF基因的功能以及研究人類多種疾病奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑 迫殺版納微型豬近交系6月齡、體質(zhì)量12 kg的母豬1頭，取淋巴結(jié)、中腦、卵巢、間腦、大腦、肝、腎、脾、心、肺、神經(jīng)纖維、胃、小腸、大腸、胰、皮膚、肌肉、脂肪18種樣品，液氮速凍，-80℃保存；RNAiso Plus、RNA PCR Kit（AMV）反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Agarose Gel DNA Purification Kit等試劑盒以及pMD18-T Vector、E.coliCompetent Cells DH5α、DL2000 DNA Marker等均購自TaKaRa公司。

1.2 RNA提取及cDNA合成 按試劑盒步驟提取組織樣品總RNA。利用核酸蛋白定量儀檢測RNA的濃度及純度（OD260nm/OD280nm）。采用RNA PCR Kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。cDNA合成體系：0.5μg的Total RNA，0.5μL 的 2.5μmol/L Oligo dT-Adaptor Primer，1μL的 10mmol/L dNTPm ix，1μL的10×RT Buffer，2μL 的 25 mmol/L MgCl2,0.5μL的 5 U/μL AMV Reverse Transcriptase， 0.25 μL 40 U/μL 的 RNase Inhibitor，DEPC-treated water補(bǔ)齊至10μL。反應(yīng)條件為：30℃10min，50℃30m in，95℃5m in，5℃5 Min。

1.3 PCR引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)序列EU714324，利用Primer Premier 5.0和Oligo 6軟件設(shè)計(jì)特異引物擴(kuò)增VEGF全長編碼區(qū)及部分側(cè)翼序列共847 bp的片段，并根據(jù)測序得到的版納微型豬近交系VEGF編碼區(qū)序列，設(shè)計(jì)特異引物擴(kuò)增155 bp片段，用于多種組織RT-PCR，并以18S看家基因?yàn)閮?nèi)參擴(kuò)增145 bp片段（表1），均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 VEGF和18S基因的PCR引物Table 1 PCR primers of VEGF and 18S

1.4 PCR擴(kuò)增 利用25μL反應(yīng)體系：12.5μL的GC BufferⅠ，10μmol/L引物各 0.5μL，4μL的2.5 mmol/L dNTPm ix，0.25 μL 5 U/μL TaqE，1 μL 25 ng/μL cDNA，6.25μL ddH2O。擴(kuò)增條件為：94℃1 Min；94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 2 min，40個(gè)循環(huán)；4℃。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 目的基因的克隆和鑒定 取切膠回收的純化產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，反應(yīng)體系：1μL pMD18-T載體，3μLDNA目的片段，1μL水，5μLSolutionⅠ。恒溫循環(huán)水浴16℃連接16 h后轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，過夜培養(yǎng)，通過菌落藍(lán)白斑篩選、菌液PCR鑒定后，陽性菌液由北京百泰克生物技術(shù)有限公司利用通用引物M 13進(jìn)行測序。

1.6 多種組織RT-PCR擴(kuò)增 分別以18種組織的cDNA為模板，利用F2/R2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)以18S看家基因做內(nèi)參對(duì)照。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離目的片段。

1.7 數(shù)據(jù)編輯和分析 測序結(jié)果使用DNAStar軟件初步編輯、比對(duì)，人工校對(duì)，并推導(dǎo)出氨基酸序列，利用ClustalX、MEGA4等軟件進(jìn)行氨基酸同源性比較，并構(gòu)建多物種系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1VEGF基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果 以BM IcDNA為模板，采用特異性引物F1/R1對(duì)VEGF基因進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果擴(kuò)增約850 bp的目的片段，與預(yù)期結(jié)果（847 bp）相符（圖1）。

圖1 VEGF基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The amplification of VEGF gene by RT-PCR

2.2VEGF基因信息及對(duì)應(yīng)蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析通過對(duì)PCR產(chǎn)物及克隆后提取的陽性質(zhì)粒雙向測序，得到一條長度為847 bp的cDNA整合序列，GenBank登錄號(hào)為JF831364，其中包含573 bp的全長CDS序列，編碼190個(gè)氨基酸（圖2）。

2.3 BM I等9個(gè)物種的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹 利用DNAstar、Mega、Cluster、DNAMan 等生 物 信 息 學(xué)軟件將由版納微型豬近交系VEGFCDS序列推導(dǎo)的氨基酸序列與牛（NP_776641）、貓（NP_001009 854）、兔（ACA23169）、人（AAC63143）、綿羊（AAD29683）、馬 （NP_001075290）、 大 鼠 （AAA4 1211）、 小 鼠（AAB22253）的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，相似性分別為97%、97%、97%、96%、96%、96%、91%和91%。利用VEGF的氨基酸序列構(gòu)建了BM I豬、牛、貓、兔、人、綿羊、馬、大鼠、小鼠9個(gè)物種的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）。

2.4 多組織轉(zhuǎn)錄水平檢測 根據(jù)測得的VEGF全長編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)特異性引物F2/R2擴(kuò)增VEGF 155 bp片段，同時(shí)以看家基因18S為內(nèi)參（擴(kuò)增145 bp片段），檢測BM I 18組織的轉(zhuǎn)錄水平（圖4）。

圖3 VEGF分子系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 The phylogenetic tree based on VEGF am ino acid sequences

圖4 VEGF基因多組織轉(zhuǎn)錄水平檢測結(jié)果Fig.4 The transcription level of VEGF gene in different tissues of BM I

3 討論

VEGF基因在免疫反應(yīng)等方面起著重要的作用[9-10]，為深入了解豬VEGF基因mRNA在各組織中轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)情況，本研究克隆版納微型豬近交系VEGF基因全長編碼區(qū)序列，利用Protein BLAST工具對(duì)所推導(dǎo)的VEGF蛋白氨基酸序列進(jìn)行檢測，顯示存在PDGF/VEGF超家族的特征（aa 49~aa 132）。比較版納微型豬近交系VEGF基因CDS編碼 區(qū) 和 GenBank內(nèi) 錄入 的 EU714324、X81380、AF318502、NM_214084等豬VEGF基因 CDS編碼區(qū)，顯示版納微型豬近交系VEGF序列（JF831364）和EU714324序列完全一致。與X81380序列在編碼區(qū)的 第 15位 不 同（c.15C>G）， 與 AF318502及NM_214084序列在第 304位（c.304A>G）和 438位（c.438A>G）不同，其中第15位和第438位為密碼子第3位堿基突變，編碼的氨基酸沒有發(fā)生改變，僅第304位為密碼子第1位堿基發(fā)生突變，導(dǎo)致在BM I中編碼的氨基酸為蘇氨酸，而在AF318502及NM_214084序列中編碼的氨基酸為丙氨酸。BM I VEGF氨基酸和牛、貓、兔、人、綿羊、馬、大鼠、小鼠8個(gè)物種的VEGF氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析表明，相似性均在90%以上，表明VEGF基因在進(jìn)化中保守性較強(qiáng)。以18S rRNA為內(nèi)參對(duì)照校正的多組織表達(dá)譜表明BM IVEGF基因在各臟器中均有轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，但在各臟器中又存在明顯的差異表達(dá)現(xiàn)象，在卵巢、脾、心、肺及皮膚中表達(dá)量明顯高于其他組織。

豬是研究各種疾病的最佳模型動(dòng)物之一，版納微型豬近交系是利用我國特有地方豬種資源，歷經(jīng)30余年連續(xù)高度近交培育的世界上第一個(gè)大型哺乳類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物近交系，它將為生命科學(xué)多個(gè)領(lǐng)域的研究提供大型純系哺乳類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。9個(gè)物種進(jìn)化關(guān)系分析顯示版納微型豬近交系VEGF基因與人類VEGF基因關(guān)系最近，與牛、羊、兔、貓、馬、大鼠及小鼠關(guān)系略遠(yuǎn)，這也提示版納微型豬近交系是研究人類VEGF基因較好的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，其不僅可以為人類各種腫瘤、腎臟及肝臟疾病、糖尿病等的研究提供最佳實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，在不久的將來也可以為豬→人異體器官移植提供大量供體器官。

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