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    雞源大腸桿菌在亞抑菌濃度頭孢菌素誘導(dǎo)下的體外耐藥表型

    2012-08-30 01:25:52潘玉善劉建華胡功政
    關(guān)鍵詞:雞源頭孢曲松沙星

    苑 麗,吳 華,潘玉善,劉建華,胡功政

    (河南農(nóng)業(yè)大學(xué),河南鄭州 450002)

    目前禽源臨床分離致病菌的多重耐藥現(xiàn)象較為嚴(yán)重[1-4],為獸醫(yī)臨床有效防控該細(xì)菌病造成了一定困難。細(xì)菌獲得多重耐藥的因素有很多[5],其中臨床不合理用藥是重要的原因之一。為研究臨床用藥對細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的影響,本實(shí)驗(yàn)選取臨床分離株LG30雞源大腸桿菌(Escherichia coli)和標(biāo)準(zhǔn)株O78為研究對象,采用亞抑菌濃度的頭孢曲松或頭孢噻肟單藥為誘導(dǎo)藥物,檢測不同誘導(dǎo)期的誘導(dǎo)菌對常用藥物的耐藥性變化,為臨床合理用藥及進(jìn)一步研究禽源分離菌的多重耐藥機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 受試菌株LG30雞源E.coli為本實(shí)驗(yàn)室臨床分離鑒定并保存;標(biāo)準(zhǔn)株O78購自中國獸藥監(jiān)察所;氨芐西林(新鄉(xiāng)華星藥廠,含量89.6%,批號070803)、頭孢曲松(廣州白云山制藥總廠,含量94.8%,批號070860)、頭孢噻肟鈉(齊魯動物保健品有限公司,含量89.1%,批號070400301)、頭孢噻呋(美國法瑪西亞普強(qiáng)公司,含量95.8%,批號070406)、鹽酸頭孢吡肟(悅康藥業(yè)集團(tuán)有限公司,含量89.4%,批號0705051)、加替沙星(臺州外高橋聯(lián)通藥業(yè)有限公司,含量99.5%,批號061022)、恩諾沙星(浙江康裕制藥有限公司,含量98%,批號070509)、克林沙星、慶大霉素、阿米卡星、氟苯尼考等均為國產(chǎn)藥,使用時均在有效期內(nèi)。

    1.2 菌種復(fù)活及培養(yǎng) 將各保存菌液50μL分別接種于5 ML LB肉湯中,37℃培養(yǎng)18 h~24 h,接種于LB瓊脂平板,37℃過夜培養(yǎng)。次日,分別挑取平板上1~2個典型菌落接種于LB肉湯,37℃培養(yǎng)18 h~24 h,4℃保存作為種用。

    1.3 體外藥敏試驗(yàn) 參照CLSI(2010)[6]推薦的微量稀釋法測定各受試藥對細(xì)菌的最小抑菌濃度(M inimal inhibitory concertration,M IC)值,并分析各受試藥物的耐藥率。試驗(yàn)時,受試菌的菌懸液濃度約為105cfu/mL。試驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果取平均值。

    1.4 誘導(dǎo)培養(yǎng) 將新鮮培養(yǎng)的受試菌液0.5 ML接種于4 ML LB肉湯中,再加入0.5 ML適量濃度的頭孢曲松或頭孢噻肟,使肉湯內(nèi)的藥物濃度為相應(yīng)菌株的1/2 MIC,37℃培養(yǎng)18 h~24 h,計(jì)為培養(yǎng)一代。每天繼代一次,共計(jì)培養(yǎng)30代,每隔3代做一次體外藥敏試驗(yàn),調(diào)整肉湯中的藥物濃度,使之始終保持約1/2 MIC。每隔10代如上法做體外藥敏試驗(yàn)。

    2 結(jié)果與討論

    不同代次不同藥物誘導(dǎo)菌株對氨芐西林、慶大霉素和恩諾沙星等11種常見抗菌藥的體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表1。

    2008年,M iranda等在研究648株雞源E.coli對恩諾沙星、多西環(huán)素和磺胺等三類藥物使用期、殘留期及未用藥期的耐藥率差異時表明,在用藥期間雞源E.coli的耐藥率顯著升高,并由此推斷雞群中應(yīng)用抗菌藥將有助于雞源E.coli篩選出耐藥菌株[7]。在本實(shí)驗(yàn)中,由表可知,受試菌誘導(dǎo)前對受試藥均呈現(xiàn)敏感,各藥的M IC值為<0.13μg/mL~8μg/mL。菌株在含有適量頭孢噻肟或頭孢曲松的LB肉湯中連續(xù)培養(yǎng)至10代時,O78誘導(dǎo)菌對頭孢噻肟和頭孢曲松的敏感性均有明顯降低,兩藥的M IC值升高了8倍~64倍,但O78誘導(dǎo)菌仍保持敏感。當(dāng)誘導(dǎo)培養(yǎng)至20代時,O78誘導(dǎo)菌對兩藥的敏感性繼續(xù)下降,兩藥的M IC值又升高了2倍~16倍,并且頭孢噻肟誘導(dǎo)的O78菌已對三代頭孢產(chǎn)生耐藥。此外,4個20代誘導(dǎo)菌除了對頭孢吡肟仍保持敏感,對加替沙星和克林沙星呈敏感或中介外,對其他種類的藥物(包括慶大霉素、阿米卡星、氟苯尼考及恩諾沙星)均已呈現(xiàn)耐藥。當(dāng)繼續(xù)誘導(dǎo)至30代時,各菌株對藥物的敏感性進(jìn)一步降低,耐藥程度進(jìn)一步增強(qiáng),但各藥的M IC值升高速率減慢。表明在頭孢類抗菌藥的持續(xù)性選擇性壓力下,細(xì)菌獲得多重耐藥表型的速度是非常快速的,并且不同藥物誘導(dǎo)的菌株對藥物的敏感性差異僅與誘導(dǎo)代數(shù)密切相關(guān),與誘導(dǎo)藥物(頭孢噻肟和頭孢曲松)的品種無明顯關(guān)系。有意思的是,細(xì)菌通過此種方式獲得的耐藥表型并不僅僅針對誘導(dǎo)藥物,而是以幾乎相同的速度向多重耐藥發(fā)展,即在頭孢類藥物誘導(dǎo)下,細(xì)菌不僅能夠?qū)︻^孢類藥物產(chǎn)生耐藥,而且還能夠同時對其他種類藥物產(chǎn)生耐藥,從而突變?yōu)槎嘀啬退幘闧8-9]。分析原因可能是誘導(dǎo)菌在藥物選擇性壓力下發(fā)生了非特異性的適應(yīng)性改變,如細(xì)菌的細(xì)胞膜通透性下降、細(xì)菌產(chǎn)生了多藥外排泵或細(xì)菌形成了生物被膜等[10-11]。

    表1 受試菌對11種抗菌藥物的敏感性檢測結(jié)果(μg/mL)Table 1 The susceptibilities of isolates against antim icrobial agents(μg/mL)

    [1]賴婧,劉洋,汪宇,等.800株不同動物源大腸桿菌的耐藥性監(jiān)測[J].中國獸醫(yī)雜志,2011,47(4):12-14.

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    [4]陳紅羽,馮占雨.在食品動物中謹(jǐn)慎地使用人醫(yī)上重要的抗生素[J].國外畜牧學(xué)-豬與禽,2011,31(2):41-43.

    [5]趙明秋,沈海燕,潘文,等.細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的原因、機(jī)制及防治措施[J].中國畜牧獸醫(yī),2011,38(5):177-181.

    [6]CLSI(2010).Performance standards for antimicrobial susceptibility testing,20th informational supplement,M 100-S20.Wayne,PA:Clinical and Laboratory Standards Institute.

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    [11]賈艷華,李鳳娟,劉建華,等.雞源大腸桿菌生物被膜的耐藥性分析[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2008,23(2):191-197.

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